Procedimiento para la detección de interferencias en ensayos de diagnóstico in vitro.

Procedimiento para la identificación de factores perturbadores de interferencia en una muestra,

que en un primer procedimiento de ensayo, en el que se pone en contacto la muestra para la detección de un analito en la muestra con uno o varios componentes funcionales para la detección del analito, proporciona un primer resultado de ensayo, caracterizado porque la muestra en un segundo procedimiento de ensayo se somete a ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que un componente funcional para la detección del analito en la muestra no se pone en contacto con la muestra.

Procedimiento para la detección de interferencias en ensayos de diagnóstico in vitro La presente invención se basa en el campo del diagnóstico in vitro y se refiere a un procedimiento para la detección de interferencias en una muestra.

Se conoce que el material de muestra humano (entre otros, plasma o suero) puede contener anticuerpos antiinmunoglobulina contra inmunoglobulinas animales (anticuerpos heterófilos) y/o contra inmunoglobulinas humanas (factor reumatoide, RF) . Estos anticuerpos contenidos en el material de muestra pueden influir negativamente en procedimientos de detección de diagnóstico in vitro, en particular inmunoensayos, reaccionando de manera no específica con uno o varios componentes funcionales, que se usan en el procedimiento de detección (por ejemplo anticuerpos) . De esta manera se producen erróneamente resultados de ensayo demasiado altos o, con menor frecuencia, se producen erróneamente resultados de ensayo demasiado bajos.

El primer indicio de que una muestra pudiera contener anticuerpos de interferencia u otros factores perturbadores, consiste habitualmente en un resultado de ensayo inesperado, que dado el caso está en contradicción con otros hallazgos clínicos del paciente.

Para evitar interferencias mediante anticuerpos intrínsecos de la muestra se usan con frecuencias las denominadas sustancias de bloqueo, que neutralizarán el efecto de los anticuerpos intrínsecos de la muestra en la preparación de ensayo. Como sustancias de bloqueo se usan por ejemplo mezclas de distintas inmunoglobulinas IgG policlonales, inmunoglobulinas IgG polimerizadas, mezclas de anticuerpos monoclonales, inmunoglobulinas IgM anti-ser humano monoclonales y similares (para una visión general véase Kricka, L. J., Human anti-animal antibody interferences in immunological assays. Clin. Chem. 1999, 45 (7) : 942-956) . Las sustancias de bloqueo pueden estar contenidas en un reactivo que se usa para llevar a cabo el procedimiento de detección. Tampoco cuando se encuentra disponible una serie de sustancias de bloqueo comercialmente disponibles, queda claro no obstante si el uso de una sustancia de bloqueo determinada garantiza la neutralización de todos los anticuerpos de interferencia posibles.

Una posibilidad de probar si una muestra, para la que se midió un resultado de ensayo inesperadamente alto en un primer procedimiento de detección, contiene sustancias de interferencia, consiste en la repetición de la medición con distintas diluciones de la muestra. Se conoce que el efecto perturbador de anticuerpos de interferencia habitualmente no disminuye linealmente al aumentar la dilución. En esto es desventajoso que deben medirse varias diluciones y que no se detectan anticuerpos de interferencia, cuyo efecto perturbador en cambio disminuye excepcionalmente de forma lineal al aumentar la dilución.

Otra posibilidad de probar si una muestra, para la que se midió un resultado de ensayo inesperadamente alto en un primer inmunoensayo de tipo sándwich, contiene sustancias de interferencia, consiste en usar sólo uno de los dos anticuerpos específicos de analito usados en el inmunoensayo de tipo sándwich como anticuerpo de captura y de detección (Boscato, L. M. y Stuart, M C., Incidence and specificity of interference in two-site immunoassays. Clin. Chem. 1986, 32 (8) : 1491-1495) . En esto es desventajoso que debe llevarse a cabo la prueba para cada uno de los anticuerpos usados en el inmunoensayo y que para ello deben prepararse reactivos especiales.

La presente invención se basaba en el objetivo de proporcionar un procedimiento para la identificación de una muestra que contiene factores perturbadores de interferencia, que es menos costoso que los procedimientos del estado de la técnica.

El objetivo se resuelve por que una muestra, que en un primer procedimiento de ensayo, en el que la muestra para la detección de un analito en la muestra se pone en contacto con uno o varios componentes funcionales, proporciona un primer resultado de ensayo, en un segundo procedimiento de ensayo se somete a ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que un componente funcional para la detección del analito en la muestra no se pone en contacto con la muestra.

Si en el segundo procedimiento de ensayo se obtiene un resultado de ensayo cuantitativamente significativo, esto indica la existencia de un factor perturbador, que interfiere con el primer procedimiento de ensayo.

La omisión de un componente funcional de un sistema de ensayo provoca normalmente que no tenga lugar la reacción necesaria para la generación de señales entre analito y componente (s) de unión. No obstante, si se produce una reacción, que genera una señal medible, ésta ha de valorarse como no específica e indica la existencia de factores perturbadores intrínsecos de la muestra. Por lo tanto, ha de cuestionarse el verdadero resultado de ensayo de la muestra, y el analito que va a someterse a ensayo ha de examinarse preferentemente con ayuda de un procedimiento alternativo.

Por la expresión "factores perturbadores de interferencia" se entienden todos los factores intrínsecos de la muestra que perturban la detección cualitativa o cuantitativa de un analito en una muestra, interaccionando con uno o varios componentes del sistema de detección, mediante lo cual se miden erróneamente resultados demasiado altos. Ejemplos de tales factores perturbadores son anticuerpos anti-inmunoglobulina contra inmunoglobulinas animales (anticuerpos heterófilos) , en particular anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) , y anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas (factor reumatoide, RF) .

Por un "primer procedimiento de ensayo, en el que la muestra para la detección de un analito en la muestra se pone en contacto con uno o varios componentes funcionales" ha de entenderse cada procedimiento para la detección cualitativa o cuantitativa de un analito en una muestra. En particular se entienden por ello procedimientos en los que la muestra se pone en contacto con al menos un componente de unión específico de analito y se detecta la reacción de unión. Son ejemplos en particular inmunoensayos en los que se detecta la unión antígeno-anticuerpo.

Por un "segundo procedimiento de ensayo, que se diferencia del primer procedimiento de ensayo únicamente por que un componente funcional para la detección del analito en la muestra no se pone en contacto con la muestra" ha de entenderse un procedimiento que, a excepción de un único componente funcional, presenta todos los componentes funcionales y condiciones de ensayo del primer procedimiento de ensayo.

Por un "componente funcional para la detección del analito" se entienden todos los componentes del primer procedimiento de ensayo que son indispensables para la detección específica del analito en el sistema de ensayo, tal como por ejemplo un componente de unión de unión a analito, por ejemplo un anticuerpo, o un componente de unión secundario, que une el componente de unión de unión a analito.

En una forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, en el caso del primer procedimiento de ensayo, en el que la muestra para la detección de un analito en la muestra se pone en contacto con uno o varios componentes funcionales, se trata de un ensayo de aglutinación de partículas para la determinación de la actividad de VWF. En este ensayo de actividad de VWF, se pone en contacto la muestra con proteína GPIb aislada, que en ausencia de ristocetina se une a VWF, y con micropartículas, que están recubiertas con un anticuerpo anti-GPIb monoclonal, como componentes funcionales y se mide la reacción de aglutinación (documento WO 2009/007051 A2) .

Para la identificación de factores perturbadores de interferencia en una muestra, que se sometió a ensayo con el ensayo de actividad de VWF descrito anteriormente, se somete a ensayo la muestra en un segundo procedimiento de ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que no se pone en contacto ninguna proteína GPIb aislada con la muestra. Esto tiene la ventaja de que únicamente en un reactivo se prescinde de un componente funcional. Todos los demás componentes permanecen, incluso la disolución tampón, en la que se encuentra el componente funcional proteína GPIb del primer procedimiento de ensayo.

Como alternativa, la muestra puede someterse a ensayo en un segundo procedimiento de ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que las micropartículas, que se ponen en contacto con la muestra, no están recubiertas con anticuerpos anti-GPIb.

En otra forma de realización preferida,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación de factores perturbadores de interferencia en una muestra, que en un primer procedimiento de ensayo, en el que se pone en contacto la muestra para la detección de un analito en la muestra con uno o varios componentes funcionales para la detección del analito, proporciona un primer resultado de ensayo, caracterizado porque la muestra en un segundo procedimiento de ensayo se somete a ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que un componente funcional para la detección del analito en la muestra no se pone en contacto con la muestra.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra en un primer procedimiento de ensayo para la detección de la actividad de VWF en la muestra se pone en contacto con proteína GPIb aislada y con micropartículas, que están recubiertas con anticuerpos anti-GPIb y en el que la muestra en un segundo procedimiento de ensayo se somete a ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que proteína GPIb aislada no se pone en contacto con la muestra.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra en un primer procedimiento de ensayo para la detección del factor de von Willebrand en la muestra se pone en contacto con proteína GPIb aislada y con micropartículas, que están recubiertas con anticuerpos anti-GPIb y en el que la muestra en un segundo procedimiento de ensayo se somete a ensayo, diferenciándose el segundo procedimiento de ensayo del primer procedimiento de ensayo únicamente por que las micropartículas, que se ponen en contacto con la muestra, no están recubiertas con anticuerpos anti-GPIb.