Inmunoconjugados dirigidos.

Inmunconjugado que comprende:

(a) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla,

y

(b) una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que dicha fracción efectora de cadena sencilla es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora.

Inmunoconjugados dirigidos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención

La presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprenderá) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y (b) un primer y un segundo dominios de unión a antígeno, en el que dicha fracción de cadena sencilla es una citoquinas seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-a (INF-a) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora. La presente invención se refiere de manera general a inmunoconjugados específicos de antígeno para administrar selectivamente fracciones efectoras que influyen sobre la actividad celular. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos inmunoconjugados, y a vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere además a métodos para producir los inmunoconjugados indicados en la presente memoria, y a composiciones que comprenden dichos inmunoconjugados para la utilización en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes de la técnica

La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo celular específico con frecuencia resulta deseable en una diversidad de contextos clínicos. Por ejemplo, es un objetivo primario de la terapia del cáncer destruir específicamente células tumorales, dejando intactas y sin daños las células y tejidos sanos. Una multitud de rutas de transducción de señales en la célula se encuentran ligadas a la supervivencia y/o muerte de la célula. Por consiguiente, la administración directa de un factor de la vía implicado en la supervivencia o muerte celulares se utiliza para el mantenimiento o destrucción de la célula.

Las citoquinas son moléculas de señalización celular que participan en la regulación del sistema inmunológico. Al utilizarse en la terapia del cáncer, las citoquinas pueden actuar como agentes inmunomoduladores que presentan efectos antitumorales y que pueden incrementar la inmunogenicidad de algunos tipos de tumores. Sin embargo, la rápida eliminación de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de dosis elevadas de la citoquina con el fin de conseguir una concentración de la citoquina en el sitio tumoral que resulte suficiente para activar una respuesta inmunológica o para presentar un efecto antitumoral. Estos niveles elevados de citoquina sistémica pueden conducir a toxicidad severa y a reacciones adversas.

Una manera de administrar un factor de ruta de transducción de señales, tal como una citoquina, en un sitio específico in vivo (por ejemplo un tumor o microambiente tumoral) es conjugar el factor con una inmunoglobulina específica para el sitio. Las primeras estrategias destinadas a administrar factores de la ruta de transducción de señales, tales como citoquinas, en un sitio específico in vivo incluían cadenas pesadas de inmunoglobulina conjugadas con diversas citoquinas, incluyendo linfotoxina, factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina-2 (IL- 2) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM). Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se conjugaron químicamente a una citoquina o el conjugado de inmunoglobulina-citoquina se expresó en forma de una proteína de fusión Ver Nakamura K. y Kubo A., Cáncer Supplement 8:-265-2655, 1997; Jun L. et al., Chin. Med. J. 113:151-153, 2, y Becker J.C., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7826-7831, 1996. Los investigadores han observado que, no sólo eran capaces de dirigir citoquinas a sitios específicos in vivo, sino que también podían aprovechar el hecho de que los anticuerpos monoclonales presentan vidas medias en suero más largas que la mayoría de las demás proteínas. Debido a la toxicidad sistémica asociada a las dosis altas de determinadas citoquinas no conjugadas, es decir IL-2, la capacidad de una proteína de fusión de inmunoglobulina-citoquina de maximizar las actividades inmunoestimuladoras en el sitio de un tumor, manteniendo al mínimo los efectos sistémicos secundarios, a una dosis menor, llevó a los investigadores a creer que los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citoquina eran agentes terapéuticos óptimos. Sin embargo, una de las principales limitaciones a la utilidad clínica de las inmunoglobulinas como agentes de administración es su incorporación inadecuada y pobre distribución en los tumores, parcialmente debido al gran tamaño de la molécula de inmunoglobulina Ver Xiang J. et al., Immunol. Cell Biol. 72:275-285 (1994). Además, se ha sugerido que los inmunoconjugados de inmunoglobulina- citoquina pueden activar el complemento e interactuar con receptores Fe. Esta característica inherente a las inmunoglobulinas se ha percibido desfavorablemente debido a que los inmunoconjugados terapéuticos pueden dirigirse a células que expresan receptores Fe y no a las células preferentes portadoras de antígenos. Un enfoque para superar dichos problemas es la utilización de fragmentos de inmunoglobulina manipulados. Numerosos estudios han detallado las características de los inmunoconjugados de fragmento de inmunoglobulina-citoquina. Ver Savage P. et al., Br. J. Cáncer 67:34-31, 1993; Harvill E.T. y Morrison S.L., Immunotechnol. 1:95-15, 1995, y Yang J. et al.. Mol. Immunol. 32:873-881, 1995 En general, existen dos constructos comunes de proteína de fusión

de fragmento de ¡nmunoglobulina-citoquina: F(ab)2-c¡toqu¡na expresado en células de mamífero y scFv-citoquina expresado en Escherichia coli. VerXiang J., Hum. Antlbodles 9:23-36, 1999. Tanto la reactividad de unión a tumor de la molécula parental de ¡nmunoglobulina como la actividad funcional de la citoquina se mantienen en la mayoría de dichos tipos de inmunoconjugado. Algunos estudios preclínicos recientes han demostrado que dichas proteínas de fusión son capaces de dirigir citoquinas a tumores que expresan el antígeno asociado a tumor in vivo, y de inhibir tumores tanto primarios como metastásicos en un modelo animal inmunológicamente competente.

Entre los ejemplos de inmunoconjugados de fragmento de ¡nmunoglobulina-citoquina se incluyen el inmunoconjugado scFv-IL-2, tal como se proporciona en la solicitud publicada de patente PCT n° WO 21/62298 A2, el inmunoconjugado de fragmento de cadena pesada de ¡nmunoglobulina-GM-CSF, tal como se proporciona en la patente US n° 5.65.15, el inmunoconjugado proporcionado en la solicitud publicada de patente PCT n° WO 26/119897 A2, en el que la primera subunidad de scFv-IL-12 comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de IL-12-scFv, y el inmunoconjugado tal como se describe en la solicitud publicada de patente PCT n° WO 99/29732 A2, en el que el fragmento de cadena pesada de lg-IL-12 primera subunidad comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de fragmento de cadena pesada de lg-IL-12. También se han descrito inmunotoxinas basadas en fragmentos de ¡nmunoglobulina. El documento n° wo 98/39363 describe inmunotoxinas en las que dos subunidades, consistiendo cada una de una fracción toxina acoplada con una fracción de unión a antígeno basada en un fragmento scFv o Fab, se unen mediante un enlace disulfuro para formar moléculas divalentes. El documento n° WO 29/17823 describe inmunotoxinas diftéricas basadas en diacuerpos. Aunque estos inmunoconjugados de segunda generación presentan algunas propiedades mejoradas en comparación con los conjugados de ¡nmunoglobulina-citoquina de primera generación, el desarrollo de más agentes terapéuticos específicos todavía más seguros resulta deseable para una mayor eficacia contra las células tumorales y una reducción del número y gravedad de los efectos secundarios de estos productos (por ejemplo toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc.). Además, resulta deseable identificar maneras de estabilizar adicionalmente los inmunoconjugados manteniendo niveles de actividad terapéutica aceptables.

La presente invención proporciona inmunoconjugados que muestran una eficacia mejorada, una especificidad de acción elevada, toxicidad reducida, y estabilidad mejora en sangre en comparación con los inmunoconjugados

conocidos.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona inmunoconjugados que muestran una... [Seguir leyendo]

1. Inmunconjugado que comprende:

(a) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y

(b) una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que dicha fracción efectora de cadena sencilla es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), ¡nterferón-a (INF-a) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora.

2. Inmunoconjugado según la reivindicación 1, en el que dicho inmunoconjugado consiste esencialmente de una primera fracción efectora y primera y segunda fracciones de unión a antígeno unidas mediante una o más secuencias conectoras.

3. Inmunoconjugado según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha primera molécula de Fab se une en su extremo carboxi-terminal de cadena pesada o ligera al aminoácido amino-terminal de dicha fracción efectora, y dicha fracción efectora se une en su aminoácido carboxi-terminal con el aminoácido amino-terminal de la cadena pesada o ligera de la segunda molécula de Fab.

4. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el mismo antígeno.

5. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para antígenos diferentes.

6. Inmunoconjugado según la reivindicación 4 ó 5, en el que dichas primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste de proteína activada por fibroblastos (PAF), proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma (PCSM), dominio A2 de la tenascina (TNC-A2), dominio A2 de la tenascina (TNC-A1) y dominio extra B de la fibronectina (DEB).

7. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEC ID n° 195, SEC ID n° 199, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 27, y una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEC ID n° 189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 21, SEC ID n° 25.

8. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a

antígeno son específicas para la proteína activada por fibroblastos (PAF) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° 93, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131, SEC ID n° 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175, y una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID

n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID

n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173.

9. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a

antígeno son específicas para el proteoglicano crondroitín-sulfato del melanoma (PCSM) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de reglón variable de cadena pesada de SEC ID n° 257 ó a la secuencia SEC ID n° 261 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 259 ó a la secuencia SEC ID n° 271.

1. Inmunoconjugado según la reivindicación 1, en el que dicha citoquina es IL-2.

11. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido codifica:

(i) las cadenas pesadas de dicha primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora,

(ii) las cadenas ligeras de dicha primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora, o

(iii) una cadena ligera de dicha primera fracción de unión a antígeno, una cadena pesada de dicha segunda fracción de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora.

12. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11.

13. Método para producir el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que el método comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 12 bajo condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado.

14. Composición que comprende el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 y un portador farmacéutico.

15. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 para la utilización en el tratamiento de 15 una enfermedad en un paciente en necesidad del mismo.

16. Inmunoconjugado para la utilización según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad es el cáncer.