Dispositivo y procedimiento de identificación y de determinación de grupos sanguíneos.

Dispositivo para la identificación y la determinación de grupos sanguíneos a partir de una muestra de sangre entera,

caracterizado por que comprende un soporte sólido (1) que comprende por lo menos una zona reactiva (4) sobre la cual se deposita la sangre y sobre la cual se lee el resultado, estando dicha zona reactiva constituida por lo menos por:

- una membrana porosa (3) de polímero de polietileno de alta densidad, que presenta unos poros de diámetro comprendido entre 1 y 20 μm, impregnada por unos reactivos anticuerpos monoclonales o unos reactivos antiglobulinas que permiten la inmovilización de los anticuerpos plasmáticos, y

- una membrana absorbente (2), destinada a recuperar el exceso de sangre de la muestra analizada.

Dispositivo y procedimiento de identificación y de determinación de grupos sanguíneos.

La presente invención se refiere a un dispositivo para la identificación y la determinación de antígenos eritrocitarios de grupos sanguíneos y de los anticuerpos plasmáticos correspondientes a partir de una muestra de sangre entera.

La invención se refiere asimismo a la utilización de este dispositivo, a un procedimiento que utiliza este dispositivo, así como a un kit de determinación de los grupos sanguíneos.

La sangre es un tejido conjuntivo líquido presente en el hombre y en la mayoría de los animales evolucionados. A pesar de una composición celular idéntica, existe una variabilidad de los diversos elementos de la sangre, definidos por diferentes sistemas antigénicos denominados grupos sanguíneos.

En la práctica, se refiere más particularmente a los grupos sanguíneos eritrocitarios, sistemas de antígenos situados en la superficie de los glóbulos rojos, tales como, por ejemplo, los sistemas ABO, Rhesus, Kell, Duffy, MNS, Lewis, etc.

Clásicamente, la determinación de un grupo sanguíneo se realiza sobre el reconocimiento antígeno-anticuerpo. Cuando un anticuerpo específico del antígeno reconoce a este último, se fija. Generalmente, los anticuerpos utilizados en el reconocimiento de grupos sanguíneos son unas inmunoglobulinas IgM que aglutinan los glóbulos rojos.

Las técnicas utilizadas habitualmente consisten en buscar e identificar la presencia o la ausencia de antígenos de grupo sanguíneo en la superficie de los eritrocitos, o en buscar e identificar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-antígeno del grupo sanguíneo en el plasma.

En particular, para el sistema ABO, la prueba de Beth-vincent permite determinar los antígenos llevados por los glóbulos rojos, y la prueba complementaria de Simonin-Michon o la contraprueba serológica permite determinar los anticuerpos que circulan en el suero.

En la prueba de Beth-vincent, los glóbulos rojos del individuo, obtenidos después de la separación de fase de las células y del plasma, o bien por centrifugación, o bien por decantación, son puestos en presencia de reactivos anticuerpos de especificidad conocida. Generalmente, esta prueba se hace visible por observación de aglutinación de los glóbulos rojos cuando los anticuerpos reconocen los antígenos eritrocitarios correspondientes.

En la prueba de Simonin, el plasma del individuo se pone en presencia de glóbulos rojos de prueba que pertenecen cada uno a un grupo antigénico preciso del sistema ABO. Se trata de una prueba de aglutinación del plasma del individuo con los hematíes de ensayo.

Para la búsqueda de anticuerpos denominados irregulares o RAI, se trata de detectar la presencia o la ausencia en la sangre de un individuo de inmunoglobulinas dirigidas contra diversos antígenos eritrocitarios del individuo. Para ello, se busca poner en evidencia la fijación de estas inmunoglobulinas sobre los glóbulos rojos de prueba cuyos antígenos son conocidos, con la técnica de Coombs directa e indirecta, permitiendo la comparación de los resultados deducir la presencia o la ausencia de inmunoglobulinas.

Existe un gran número de procedimientos y dispositivos utilizados para el fenotipaje en el campo de la inmunologíahematología, pudiendo las técnicas ser manuales, en placa de opalina, en tubo o en pocillo de microplaca, o también completamente automatizadas con la ayuda de un robot distribuidor de la muestra y de un reactivo, agitador, incubador y lector automático. Se conocen en particular dos técnicas de referencia: las técnicas de microplacas y las técnicas de filtración por gel de ensayo.

No obstante, estas técnicas existentes de fenotipaje de grupos sanguíneos adolecen de numerosos inconvenientes.

Las técnicas de microplaca, por ejemplo, necesitan una fase de agitación que es crítica, ya que las múltiples reacciones simultáneamente presentes sobre el soporte no tienen la misma cinética de resuspensión. Deben ser realizadas bajo el control visual y es necesario estar particularmente atento a los fenómenos de adherencia de algunos reactivos.

Asimismo, en la realización de técnicas de filtración por gel de ensayo, existe también un riesgo de no detección de algunas aglutinaciones, en particular en la prueba plasmática del grupo ABO. Otro inconveniente es la detección demasiado frecuente de auto-anticuerpos en relación con las preparaciones de hematíes de ensayo, en particular las tratadas por unas enzimas proteolíticas.

Además, todas estas técnicas adolecen de un inconveniente principal, debido a que necesitan una centrifugación previa de la sangre entera con el fin de separar los elementos constitutivos de la sangre, etapa limitativa que

aumenta en gran medida el tiempo y el coste del análisis, y que necesita la utilización de centrifugadoras voluminosas y difíciles de manipular.

Con el fin de suprimir esta etapa pesada de centrifugación, se han desarrollado unas variantes, basadas en la utilización de partículas magnéticas.

Se puede citar a título de ejemplo la solicitud de patente EP 0 351 857 que describe un procedimiento de determinación inmunológica que utiliza unos marcadores magnetizados tales como unos anticuerpos o unos antígenos fijados sobre bolas de látex magnéticas. Se describe en particular una técnica RAI por inmunoadherencia en la que se aplica un campo magnético sobre unos hematíes previamente fijados en el fondo de un pocillo de microplaca, sensibilizados con el suero a ensayar, lavados y mezclados con unas bolas de látex magnéticas revestidas de una anti-inmunoglobulina.

Se conoce también la solicitud EP 0 230 768 que describe un procedimiento de co-agregación de partículas magnéticas capaces de unirse a una sustancia contenida en una muestra mediante compuestos policatiónicos en presencia de un campo magnético.

Sin embargo, estas diferentes técnicas adolecen también de numerosos inconvenientes. Son difíciles y largas de realizar, poco económicas y necesitan la utilización de dispositivos complejos y de poca movilidad.

La patente US nº 5.126.276 describe un dispositivo de detección de analitos en un fluido biológico, que comprende un soporte sólido constituido por una tarjeta sólida con varias lengüetas planas en la periferia de la tarjeta, en el que por lo menos las lengüetas comprenden una zona reactiva.

La patente US nº 5.710.049 describe un dispositivo de análisis de muestras con un trazador metálico. El documento US 2004/0096356 describe un dispositivo que permite la detección de analitos de productos lácteos.

El documento WO 2006/098803 describe un sistema para detectar la presencia de un analito en un fluido.

El documento GB 2 250 342 describe un dispositivo de determinación de grupo sanguíneo, que comprende unas zonas reactivas, en el que la zona de depósito de la muestra es distinta de las zonas reactivas y de la zona en la que se lee el resultado.

Asimismo, la presente invención pretende paliar los inconvenientes de la técnica anterior proponiendo un medio simple y eficaz para el fenotipaje de grupos sanguíneos eritrocitarios, y la identificación y determinación de los anticuerpos plasmáticos correspondientes, que presenta una precisión y una exactitud por lo menos comparables a las obtenidas por los métodos de referencia.

En particular, el objetivo de la invención es proponer un sistema económico, fácil de usar, automatizable y móvil, capaz de determinar y detectar rápidamente unos grupos sanguíneos eritrocitarios por inmovilización de los glóbulos rojos directamente a partir de una muestra de sangre entera, sin la utilización de un equipo de centrifugación y/o de un aparato de medición cualquiera.

Para responder a este objetivo, la presente invención propone un dispositivo para la identificación y determinación de grupos sanguíneos a partir de una muestra de sangre entera, que comprende un soporte sólido que comprende por lo menos una zona reactiva en la que se deposita la sangre y en la que se lee el resultado, estando dicha zona reactiva constituida por lo menos por una membrana porosa de polímero de polietileno de alta densidad, que presenta unos poros de diámetros comprendidos 1 y 20 µm, impregnada por unos reactivos anticuerpos monoclonales o unos reactivos antiglobulinas que permiten la inmovilización de los anticuerpos plasmáticos, y una membrana absorbente, destinada a recuperar el exceso de sangre de la muestra analizada. El dispositivo permite identificar y determinar unos antígenos eritrocitarios de grupos sanguíneos y/o unos anticuerpos plasmáticos correspondientes.

La invención prevé asimismo... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para la identificación y la determinación de grupos sanguíneos a partir de una muestra de sangre entera, caracterizado por que comprende un soporte sólido (1) que comprende por lo menos una zona reactiva (4)

sobre la cual se deposita la sangre y sobre la cual se lee el resultado, estando dicha zona reactiva constituida por lo menos por:

- una membrana porosa (3) de polímero de polietileno de alta densidad, que presenta unos poros de diámetro comprendido entre 1 y 20 µm, impregnada por unos reactivos anticuerpos monoclonales o unos reactivos 10 antiglobulinas que permiten la inmovilización de los anticuerpos plasmáticos, y -una membrana absorbente (2) , destinada a recuperar el exceso de sangre de la muestra analizada.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que por lo menos una zona reactiva (4) comprende 15 también un filtro 5.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado por que el filtro (5) está constituido por fibras de vidrio de diámetro comprendido entre 1 y 7 µm.

4. Dispositivo según la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que el filtro (5) está impregnado por unos reactivos capaces de aglutinar los eritrocitos.

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende un depósito (6) que contiene una solución de lavado y/o de revelación. 25

6. Utilización del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, para identificar y determinar unos grupos sanguíneos ABO, Rhesus y/o RAI a partir de una muestra de sangre entera.

7. Procedimiento de fenotipaje de grupos sanguíneos eritrocitarios, caracterizado por que comprende las etapas 30 siguientes:

- depositar una muestra de sangre entera en una zona reactiva (4) de un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 5, -dejar reaccionar durante por lo menos 30 segundos, y -aplicar una solución de lavado con el fin de eluir los elementos no unidos a la membrana porosa (3) .

8. Procedimiento de fenotipaje de grupos ABO, Rhesus y/o RAI, caracterizado por que comprende las etapas 40 siguientes:

- depositar una muestra de sangre entera sobre una zona reactiva (4) de un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, cuya membrana porosa (3) ha sido impregnada por unos reactivos anticuerpos antiantígenos específicos de los eritrocitos, 45 -dejar reaccionar durante por lo menos 30 segundos, y -aplicar una solución de lavado con el fin de eluir los elementos no unidos a la membrana porosa (3) .

9. Procedimiento de fenotipaje de grupos ABO, Rhesus y/o RAI, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

- depositar una muestra de sangre entera sobre una zona reactiva (4) de un dispositivo según la reivindicación 4, cuya membrana porosa (3) ha sido impregnada por unos reactivos antiglobulinas que permiten la 55 inmovilización de los anticuerpos plasmáticos circulantes, -depositar en dicha zona reactiva (4) unos hematíes de ensayo de antigenicidades conocidos, -dejar actuar durante por lo menos 30 segundos, .

60. aplicar una solución de lavado con el fin de eluir los elementos no unidos a la membrana porosa (3) .

10. Kit para la determinación y/o la detección de los grupos sanguíneos ABO, Rhesus y/o RAI a partir de una muestra de sangre entera, caracterizado por que comprende por lo menos: 65

- un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5,

- unos reactivos anticuerpos que permiten la determinación y la identificación de los antígenos eritrocitarios de

los grupos sanguíneos, y

- unos hematíes de ensayo que permiten la determinación y la identificación de los anticuerpos plasmáticos

circulantes.