Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso.
Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende
(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que tiene al menos 95%,
96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia con SEC ID Nº: 1, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las 13 modificaciones de nucleótidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en:
los nucleótidos en las posiciones 139 a 141 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por TTT o TTC;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 406 a 408 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por CAT o CAC;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 487 a 489 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 490 a 492 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 502 a 504 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 535 a 537 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 676 a 678 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GAT o GAC;
los nucleótidos en las posiciones 697 a 699 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por TGG;
los nucleótidos en las posiciones 823 a 825 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 865 a 867 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por GCT, GCC, GCA o GCG; y
los nucleótidos en las posiciones 1045 a 1047 de la SEC ID Nº: 1 se reemplazan por TAT o TAC;
donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC ID Nº: 2,
y retiene 100% de la actividad tras el tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia de SEC ID Nº: 2, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las trece modificaciones de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en:
el aminoácido alanina en la posición de aminoácido 47 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una fenilalanina;
el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una valina;
el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 136 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una histidina;
el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 163 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido ácido aspártico en la posición de aminoácido 164 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una arginina; el aminoácido ácido glutámico en la posición de aminoácido 168 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido glicina en la posición de aminoácido 179 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 226 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por un ácido aspártico;
el aminoácido valina en la posición de aminoácido 233 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por un triptófano;
el aminoácido glutamina en la posición de aminoácido 275 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una valina;
el aminoácido arginina en la posición de aminoácido 289 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una alanina; y
el aminoácido treonina en la posición de aminoácido 349 de la SEC. ID Nº: 2 se reemplaza por una tirosina;
donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC. ID Nº: 2 y retiene 100% de la actividad después del tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(c) la secuencia de ácido nucleico de (a) o (b) que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa pero que carece de: una secuencia señal o secuencia de proproteína, o una secuencia promotora homóloga;
(d) el ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga, o el ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que comprende además una secuencia de nucleótidos heteróloga;
(e) el ácido nucleico de (d), donde la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende, o consiste en una secuencia que codifica una secuencia señal heteróloga (líder), o un marcador o un epítopo, o la secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una secuencia promotora heteróloga o codifica una secuencia de dirección; o
(f) una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria de la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (e).
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13164378.
Solicitante: BASF Enzymes LLC.
Inventor/es: FREY,Gerhard, STEER,BRIAN, DYCAICO,MARK, KLINE,KATIE, TREFZER,AXEL, TODARO,TOM, SOLBAK,ARNE, EL-FARRAH,FATIMA, ALVARADO,ALBERTO.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01N63/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, hongos microscópicos, animales, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p. ej. encimas o productos de fermentación (que contienen compuestos de constitución determinada A01N 27/00 - A01N 59/00; algas unicelulares A01N 65/03).
- A61K48/00 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
- C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12N5/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
- C12N5/02 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
- C12N9/16 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).
PDF original: ES-2548776_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso Campo de la invención
La presente invención se refiere a fitasas, a polinucleótidos que las codifican, a usos de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, así como a la producción y aislamiento de dichos polinucleótidos y polipéptidos. En particular, la invención proporciona polipéptidos que, en condiciones de alta temperatura, tienen actividad fitasa, y fitasas que conservan su actividad después de exposición a altas temperaturas. Las fitasas de la invención pueden ser termotolerantes y/o termoestables a bajas temperaturas, además de a altas temperaturas. Las fitasas de la invención pueden usarse en productos alimenticios para mejorar el valor nutritivo de los ingredientes ricos en fitasas. Las fitasas de la invención pueden formularse como alimentos, como piensos o como complementos, por ejemplo, para ayudar a realizar la digestión del fitato. Los alimentos o piensos de la invención pueden estar en forma de gránulos, líquidos, polvos y similares. En un aspecto, las fitasas de la invención son estables frente a la desnaturalización térmica durante la granulación, y esto disminuye el coste del producto fitasa manteniendo al mismo tiempo la eficacia in vivo y la detección de la actividad en la alimentación.
Antecedentes
Los minerales son alimentos esenciales para el crecimiento de todos los organismos. Los minerales dietéticos pueden proceder de muchas fuentes materiales, incluidas las plantas. Por ejemplo, las semillas de las plantas son una fuente rica de minerales ya que contienen iones formando complejos con los grupos fosfatos de moléculas de ácido fítico. Estos minerales asociados a fitato pueden, en algunos casos, satisfacer las necesidades dietéticas de algunas especies de animales de granja, tales como rumiantes multigástricos. Por consiguiente, en algunos casos, los rumiantes requieren menos complementación dietética con fosfato inorgánico y minerales debido a que los microorganismos que se encuentran en el rumen producen enzimas que catalizan la conversión del fitato (hexafosfato de mioinositol) a inositol y fosfato inorgánico. En el proceso, se liberan los minerales que han formado complejo con el fitato. Sin embargo, la mayoría de las especies de animales de granja, no pueden utilizar eficazmente los minerales asociados a fitato. Por tanto, por ejemplo, en la producción pecuaria de animales monogástricos (por ejemplo, cerdos, aves y peces), para mejorar las tasas de crecimiento, el pienso se complementa normalmente con minerales y/o con antibióticos que modifican el medio de la flora digestiva del organismo consumidor.
Como tal, existen muchas cargas problemáticas - relacionadas con nutrición, etapas de tratamiento ex vivo, salud y medicina, conservación ambiental y gestión de recursos- que están asociadas con una hidrólisis insuficiente de fitato en muchas aplicaciones. A continuación se indican ejemplos no limitantes de estos problemas:
1) La complementación de dietas con minerales inorgánicos tiene un coste elevado.
2) La presencia de fitato no hidrolizado es indeseable y problemática en muchas aplicaciones ex vivo (por ejemplo, ocasionando la presencia de sedimento residual no deseado).
3) La complementación de dietas con antibióticos plantea una amenaza médica en seres humanos y en animales por igual, aumentando la abundancia de patógenos tolerantes a antibióticos
4) La liberación de minerales fecales no absorbidos en el medio ambiente altera y daña los ecosistemas de suelos circundantes, aguas de piscifactorías y aguas de superficie en general.
5) Las valiosas ofertas nutricionales de muchos productos alimenticios posibles permanecen sin explotar y desaprovechadas, de un modo significativo.
Por consiguiente, los productos alimenticios que contienen fitato requieren complementación con nutrientes exógenos y/o con una fuente de actividad fitasa para corregir sus deficientes ofertas nutricionales tras el consumo por una gran cantidad de especies de organismos.
Por consiguiente, en diversas aplicaciones existe una necesidad de medios que consigan una hidrólisis eficaz y rentable del fitato. Particularmente, existe una necesidad de medios que optimicen la hidrólisis del fitato en aplicaciones comerciales. En un aspecto particular, existe una necesidad de optimizar métodos de tratamiento convencionales que mejoren las ofertas nutricionales de los productos alimenticios que contienen fitato para el consumo en seres humanos y en animales de granja.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad fitasa, polinucleótidos que los codifican, usos de los polipéptidos y polinucleótidos de la invención y métodos para la producción y aislamiento de dichos polipéptidos y polipéptidos. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos que tienen actividad fitasa en condiciones de alta temperatura, y fitasas que conservan su actividad después de exposición a altas temperaturas. Las fitasas de la invención pueden usarse en productos alimenticios para mejorar el valor nutritivo de los ingredientes ricos en fitato. Las fitasas de la invención pueden formularse como alimentos o piensos o complementos para, por ejemplo, ayudar
a realizar la digestión del fitato. Los alimentos o piensos de la invención pueden estar en forma de gránulos, comprimidos, píldoras, líquidos, polvos, aerosoles y similares. En un aspecto, las fitasas de la invención son estables frente a desnaturalización térmica durante la granulación; y esto disminuye el coste del producto fitasa manteniendo al mismo tiempo la eficacia in vivo y la detección de la actividad en la alimentación.
SUMARIO:
La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que comprenden
(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad fitasa y que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 96 % 97 %, 98 % o 99 % o más con la SEC ID N°: 1, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las trece modificaciones de nucleótidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en: los nucleótidos en las posiciones 139 a 141 son TTT o TTC; los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 son GTT, GTC, GTA o GTG; los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 son GAA o GAG; los nucleótidos en las posiciones 406 a 408 son CAT o CAC; los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 son GTT, GTC, GTA o GTG; los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 son GAA o GAG; los nucleótidos en las posiciones 487 a 489 son CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG; los nucleótidos en las posiciones 490 a 492 son CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG; los nucleótidos en las posiciones 502 a 504 son CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG; los nucleótidos en las posiciones 535 a 537 son CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG; los nucleótidos en las posiciones 676 a 678 son GAT o GAC; los nucleótidos en las posiciones 697 a 699 son TGG; los nucleótidos en las posiciones 823 a 825 son GTT, GTC, GTA o GTG; los nucleótidos en las posiciones 865 a 867 son GCT, GCC, GCA o GCG; y los nucleótidos en las posiciones 1045 a 1047 son TAT o TAC donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC ID N°: 2, y retiene 100 % de la actividad después del tratamiento a 80 °C durante 30 minutos; o,
(b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más con la SEC ID N°: 2 y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las trece modificaciones de restos de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en: el aminoácido alanina en la posición de aminoácido 47 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una fenilalanina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico; el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 136 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una histidina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico; el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 163 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una arglnlna; el aminoácido ácido aspártico en la posición de aminoácido 164 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende
(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más Identidad de secuencia con SEC ID N°: 1, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las 13 modificaciones de nucleótidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en:
los nucleótidos en las posiciones 139 a 141 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan porTTT o TTC;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 406 a 408 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CAT o CAC;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 487 a 489 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA
o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 490 a 492 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 502 a 504 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 535 a 537 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 676 a 678 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAT o GAC;
los nucleótidos en las posiciones 697 a 699 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan porTGG;
los nucleótidos en las posiciones 823 a 825 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 865 a 867 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GCT, GCC, GCA o GCG; y
los nucleótidos en las posiciones 1045 a 1047 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por TAT o TAC;
donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC ID N°: 2,
y retiene 100% de la actividad tras el tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia de SEC ID N°: 2, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las trece modificaciones de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en:
el aminoácido alanina en la posición de aminoácido 47 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una fenilalanina; el aminoácido cisterna en la posición de aminoácido 97 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido cisterna en la posición de aminoácido 97 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 136 de la SEC. ID N°:
2 se reemplaza por una histidina;
el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido en la posición equivalente a la de la treonina en la posición de aminoácido 163 de la SEC. ID N°:
2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido ácido aspártlco en la posición de aminoácido 164 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido ácido glutámico en la posición de aminoácido 168 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido glicina en la posición de aminoácido 179 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una arginina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 226 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por un ácido aspártico;
el aminoácido valina en la posición de aminoácido 233 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por un triptófano; el aminoácido glutamina en la posición de aminoácido 275 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido arginina en la posición de aminoácido 289 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una alanina; y el aminoácido treonina en la posición de aminoácido 349 de la SEC. ID N°: 2 se reemplaza por una tirosina; donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC. ID N°: 2 y retiene 100% de la actividad después del tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(c) la secuencia de ácido nucleico de (a) o (b) que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa pero que carece de: una secuencia señal o secuencia de proproteína, o una secuencia promotora homologa;
(d) el ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que codifica un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga, o el ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que comprende además una secuencia de nucleótidos heteróloga;
(e) el ácido nucleico de (d), donde la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende, o consiste en una secuencia que codifica una secuencia señal heteróloga (líder), o un marcador o un epítopo, o la secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una secuencia promotora heteróloga o codifica una secuencia de dirección; o
(f) una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria de la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (e).
2. Un casete de expresión, vector, vehículo de clonación, vector de expresión, vector de clonación (i) que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, o que tiene contenido en el mismo un ácido nucleico de la reivindicación 1; o (¡i) el casete de expresión, vector, vehículo de clonación, vector de expresión, vector de clonación de (i), donde el vehículo de clonación comprende o es un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial, y opcionalmente el vector viral comprende un vector adenoviral, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado y opcionalmente el casete de expresión, vector, vehículo de clonación, vector de expresión, vector de clonación comprende o está contenido en un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plásmido, un vector derivado de bacteriófago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial de mamífero (MAC).
3. Una célula transformada o célula hospedadora (i) que comprende: el ácido nucleico de la reivindicación 1, o el casete de expresión, vector, vehículo de clonación, vector de expresión, vector de clonación de la reivindicación 2; o (ii) la célula transformada o célula hospedadora de (i), donde la célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal; (iii) la célula transformada o célula hospedadora de (ii), donde la célula bacteriana es cualquier especie dentro de los géneros Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas o Staphylococcus o Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium o Pseudomonas fluorescens.
4. Una planta o semilla transgénica (i) que comprende: el ácido nucleico de la reivindicación 1, o el casete de expresión, vector, vehículo de clonación, vector de expresión, vector de clonación de la reivindicación 2; o la célula transformada o célula hospedadora de la reivindicación 3; o (¡i) la planta o semilla transgénica de (i), y opcionalmente donde la planta es una planta de maíz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja o una planta de tabaco, o una planta de forraje y/o pienso para un animal, o para un animal rumiante, y opcionalmente la planta es o comprende forraje o pienso es heno, maíz, mijo, soja, trigo, alforfón, cebada, alfalfa, centeno, una planta herbácea anual, sorgo, pasto del Sudán, pasto de Veldt o pasto de búfalo; o, la semilla es una semilla de maíz, un grano de trigo, una semilla oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soja, un grano de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, un cacahuete o una semilla de cacahuete, una semilla de alfalfa, una semilla de algodón, una semilla de cártamo, una semilla de sorgo, un grano de avena, una semilla de centeno, una semilla de mijo, una semilla de cebada, un grano de arroz, una semilla de guisante o una semilla de planta de tabaco,
y opcionalmente la planta es maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, caña de azúcar, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coniferas, guisante, judía, soja, patata, batata, yuca, taro, caña de azúcar o remolacha azucarera.
5. Un polipéptido de fitasa aislado, sintético o recombinante que comprende
(a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEC ID N°: 2, y codificada por un ácido nucleico que comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o todas las trece modificaciones seleccionadas a partir del grupo que
consiste en:
los nucleótidos en las posiciones 139 a 141 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan porTTT o TTC;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 289 a 291 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 406 a 408 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CAT o CAC;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 475 a 477 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAA o GAG;
los nucleótidos en las posiciones 487 a 489 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA
o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 490 a 492 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 502 a 504 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 535 a 537 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA o AGG;
los nucleótidos en las posiciones 676 a 678 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GAT o GAC;
los nucleótidos en las posiciones 697 a 699 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan porTGG;
los nucleótidos en las posiciones 823 a 825 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GTT, GTC, GTA o GTG;
los nucleótidos en las posiciones 865 a 867 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por GCT, GCC, GCA o GCG; y
los nucleótidos en las posiciones 1045 a 1047 de la SEC ID N°: 1 se reemplazan por TAT o TAC;
donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC ID N°: 2,
y retiene 100% de la actividad después del tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene dal menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidades secuencia con SEC ID N°: 2, y que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o
todas las trece modificaciones de restos de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, seleccionadas a partir del grupo que consiste en:
el aminoácido alanina en la posición de aminoácido 47 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una fenilalanina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 97 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido treonina en la posición de aminoácido 136 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una histidina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido asparagina en la posición de aminoácido 159 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un ácido glutámico;
el aminoácido treonina en la posición de aminoácido 163 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una arginina; el aminoácido ácido aspártico en la posición de aminoácido 164 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido ácido glutámico en la posición de aminoácido 168 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una arginina;
el aminoácido glicina en la posición de aminoácido 179 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una arginina; el aminoácido cisteína en la posición de aminoácido 226 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un ácido aspártico;
el aminoácido valina en la posición de aminoácido 233 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por un triptófano; el aminoácido glutamina en la posición de aminoácido 275 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una valina; el aminoácido arginina en la posición de aminoácido 289 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una alanina; y el aminoácido treonina en la posición de aminoácido 349 de la SEC ID N°: 2 se reemplaza por una tirosina; donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada sobre la fitasa de la SEC ID N°: 2, y retiene 100% de la actividad después del tratamiento a 80 °C durante 30 minutos;
(c) el polipéptido de (a) o (b) que tiene una actividad fitasa pero carece de: una secuencia señal o secuencia de proproteína;
(d) el polipéptido de cualquiera de (a) a (c) que tiene una actividad fitasa y que comprende además una secuencia heteróloga;
(e) el polipéptido de (d) donde la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende, o consiste en una secuencia señal (líder) heteróloga, o un marcador o un epítopo, o la secuencia heteróloga comprende un péptido de identificación o una secuencia de dirección; o
(f) el polipéptido de cualquiera de (a) a (e), donde (i) el polipéptido está glucosilado, o el polipéptido comprende al menos un sitio de glucosilación, (ii) el polipéptido de (i) donde la glucosilación es una glucosilación ligada a N o una glucosilación ligada a O; (iii) el polipéptido de (i) o (ii) donde el polipéptido está glucosilado después de expresarse en una célula de levadura; o (iv) el polipéptido de (iii) donde la célula de levadura es una P. pastoris o una S. pombe.
6. Un método para hidrolizar un hexafosfato de inositol a inositol y fosfato inorgánico que comprende:
(i) (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad fitasa, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 5, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1; (b) proporcionar una composición que comprenda un hexafosfato de inositol; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones donde el polipéptido hidrolice el hexafosfato de inositol para producir inositol y fosfato inorgánico;
(ii) el método de (i), donde las condiciones comprenden una temperatura de entre aproximadamente 37 °C y aproximadamente 70 °C, entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 80 °C o entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 90 °C; o
(iii) el método de (i) o (ii), donde la composición comprende un ácido fítico.
7. Un método para producir una matriz comestible de liberación enzimática en forma de gránulos, que comprende:
(a) proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5 o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1; (b) proporcionar un grano, un germen de grano o un sustrato basado en grano; y (c) combinar el polipéptido de (a) y el grano, germen de grano o sustrato basado en grano de (b) para formar una matriz comestible de liberación enzimática en forma de gránulos, donde la matriz comestible de liberación se forma granulando para producir una partícula y opcionalmente los gránulos se realizan en condiciones que comprenden aplicación de vapor, opcionalmente los gránulos se realizan en condiciones que comprenden aplicación de una temperatura de más de 80 °C durante aproximadamente 5 minutos y opcionalmente el gránulo comprende una enzima fitasa que comprende una actividad específica de al menos 350 a aproximadamente 900 unidades por miligramo de enzima.
8. Un método para procesar granos de maíz y sorgo que comprende (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad fitasa, donde el polipéptido comprende el polipéptido de la reivindicación 5; (b) proporcionar una composición que comprenda un agua de macerado de maíz o un agua de macerado de sorgo y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones donde el polipéptido pueda escindir una enlace de fosfato inorgánico de inositol.
9. Una preparación proteica que comprende el polipéptido de la reivindicación 5, donde la preparación proteica comprende un líquido, una pasta espesa, un polvo, una pulverización, una suspensión, una composición/formulación liofilizada, un sólido, un comprimido recubierto con película, una píldora, un implante, un gel o una formulación farmacéutica, un alimento o un pienso o un complemento de los mismos.
10. Una composición que comprende el pollpéptldo de la reivindicación 5, donde la composición se selecciona de una unidad de Comida Individual Lista para Consumir (MRE), una bebida, un agente de hidratación, un comprimido masticable, una barra nutricional, un alimento precoclnado, un cereal de desayuno, una formulación farmacéutico, una formulación dietética, una harina de soja, un alimento, un pienso y una matriz comestible de liberación enzimática en forma de gránulos.
11. Un polipéptido de fitasa aislado, sintético o recomblnante de acuerdo con la reivindicación 5, donde las modificaciones en la secuencia de aminoácidos son una combinación de mutaciones seleccionadas entre:
(a) A47F, C97E, T136H, N159V, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289Ay T349Y;
(b) A47F, C97E, N159V, T163R, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275Vy T349Y;
(c) A47F, T136H, N159V, T163R, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V y T349Y;
(d) A47F, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289Ay T349Y;
(e) A47F, C97V, T136H, N159V, T163R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289Ay T349Y;
(f) A47F, C97V, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275Vy T349Y;
(g) A47F, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275Vy T349Y;
(h) A47F, C97E, T136H, N159V, T163R, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275Vy T349Y;
(i) A47F, C97E, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, V233W, Q275V, R289Ay T349Y;
(j) A47F, C97E, T136H, N159E, T163R, D164R, G179R, V233W, Q275V, R289A, T349Yy L363P;
(k) A47F, C97V, T136H, N159V, T163R, D164R, G179R, V233W, Q275V, R289AyT349Y;
(l) A47F, C97E, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289AyT349Y;
(m) A47F, C97E, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289AyT349Y;
(n) A47F, C97E, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289AyT349Y;
(o) A47F, C97V, T136H, N159E, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289Ay T349Y;
(p) A47F, C97E, T136H, N159V, T163R, G179R, C226D, V233W, Q275VyT349Y;
(q) A47F, C97E, T136H, N159V, T163R, D164R, E168R, G179R, C226D, V233W, Q275VyT349Y;
(r) A47F, T136H, N159E, T163R, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, R289AyT349Y;
(s) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275VyT349Y;
(t) A47F, C97V, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V y T349Y;
(u) A47F, C97V, T136H, N159V, D164R, G179R, V233W, Q275VyT349Y; y
(v) A47F, T136H, N159V, C226D, V233W y T349Y.
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