Fabricación selectiva de polipéptidos de neurotoxina recombinantes.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de neurotoxina que comprende una cadena ligera,

un enlazador y una cadena pesada, en donde el enlazador es un enlazador modificado que comprende una secuencia heteróloga de aminoácidos que confiere al menos una propiedad fisicoquímica al polipéptido que permite la separación de polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados o sin procesar de polipéptidos de neurotoxina procesados, siendo dicha secuencia heteróloga de aminoácidos flanqueada en el terminal N y C por un sitio de reconocimiento y escisión de proteasa, en donde la neurotoxina es una neurotoxina botulínica.

Fabricación selectiva de polipéptidos de neurotoxina recombinantes

La presente invención se refiere a polipéptidos de neurotoxina recombinantes y la fabricación de los mismos. Específicamente, se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de neurotoxina que comprende una cadena ligera, un enlazador y una cadena pesada, en donde el enlazador es un enlazador modificado que comprende una secuencia heteróloga de aminoácidos que confiere al menos una propiedad fisicoquímica al polipéptido que permite la separación de polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados y/o sin procesar de polipéptidos de neurotoxina procesados, estando dicha secuencia heteróloga de aminoácidos flanqueada en el terminal N y el terminal C por un sitio de reconocimiento y escisión de la proteasa. También son abarcados por la presente Invención vectores y células anfitrionas que comprenden el polinucleótido de la Invención, así como polipéptidos codificados por dicho polinucleótido y métodos para la fabricación de polipéptidos de neurotoxina procesados. La neurotoxina de la invención es neurotoxina botulínica.

Clostridium botullnum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir toxinas botulínlcas (BoNT) y toxina del tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas Clostridiales se unen específicamente a las células neuronales e Interrumpen la liberación de neurotransmisores. Cada toxina se sintetiza como una proteína Inactiva de cadena sencilla de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento postraduccional Implica la formación de puentes disulfuro, y proteóllsls limitada (corte) por la(s) proteasa(s) bacteriana(s). Una neurotoxina activa bicatenaria consiste en dos cadenas, una cadena ligera en el terminal N de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las neurotoxinas consisten estructuralmente de tres dominios, es decir, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que comprende el dominio de translocación (mitad del terminal N) y el dominio de enlazamlento al receptor (mitad del terminal C), véase Krieglstein 1990, Eur J Blochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Blochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Proteln Chem 13, 49.

La bacteria Clostridium botullnum segrega siete serotlpos antlgénicamente distintos designados de A hasta G de la neurotoxina botulínica (BoNT). Todos los serotlpos junto con la neurotoxina relacionada del tétanos (TeNT) secretados por la bacteria Clostridium tetan!, son endoproteasas que contienen Zn^ que bloquean la exocitosis sinóptica mediante la escisión de proteínas SNARE. Las CNT causan la parálisis muscular flácida observada en el botulismo y el tétanos; véase Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de toxina botulínica ha sido utilizado como un agente terapéutico en un gran número de enfermedades. La toxina botulínica serotipo A fue aprobada para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento de estrabismo, blefaroespasmo, y otros trastornos. Está disponible comercialmente como una preparación de proteína de la toxina botulínica A, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOXO (Allergan Inc.) y bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd ). Para aplicación terapéutica, se inyecta el complejo directamente en el músculo a tratar. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteína y tiene lugar el efecto farmacológico deseado. Una preparación mejorada de BoNT/A que se libera de las proteínas complejantes está disponible bajo el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). El efecto de la toxina botulínica es sólo temporal, razón por la cual puede requerirse de una administración repetida de la toxina botulínica para mantener un efecto terapéutico.

Las neurotoxinas Clostridiales debilitan la fuerza muscular voluntaria y son eficaces en el tratamiento de estrabismo, distonía focal, incluyendo distonía cervical y blefaroespasmo esencial benigno. Se ha demostrado además que alivian el espasmo hemifacial, y la espasticidad focal, y además, son eficaces en una amplia gama de otras indicaciones, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y corrección cosmética de arrugas; véase Jost 2007, Drugs 67, 669.

Para la fabricación de las neurotoxinas Clostridiales, ya sea aisladas de las bacterias Clostridiales de tipo silvestre que las originan, o de otras especies de células anfitrionas tales como E. coli, la purificación de la neurotoxina a partir de los lisados de células anfitrionas después de la fermentación es de particular importancia. En el proceso de producción clásico a partir de C/osfr/d/um usualmente se aplican diferentes etapas de precipitación y

extracción seguido por una etapa de concentración y otras etapas cromatográficas distintas con el fin de obtener neurotoxina purificada, véase DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461. Del mismo modo, en un proceso de producción recombinante a partir de otras células anfitrionas tales como E. coli, se usan diversas etapas de procesamiento tales como ruptura de células, clarificación del lisado, y múltiples etapas de purificación cromatogràfica para el aislamiento de la neurotoxina.

En la actualidad, todas las preparaciones de neurotoxina disponibles comprenden, además de la neurotoxina de doble cadena activa (procesada) deseada, un precursor proteolíticamente sin procesar y/o un polipéptido de

neurotoxina parcialmente procesado. El precursor proteolíticamente sin procesar o el polipéptido parcialmente procesado difieren del polipéptido de neurotoxina de doble cadena activo (procesado) en sólo unos pocos aminoácidos. Por lo tanto, difícilmente pueden distinguirse con base en sus propiedades químicas y físicas. Por otro lado, la proporción de precursor proteolíticamente y/o de polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado de la proporción de proteína total sigue siendo significativa en estas preparaciones. Dicha cantidad de precursor sin procesar y/o neurotoxina parcialmente procesada es inherente a los sistemas de producción biológicos, que no son completamente controlables. Por lo tanto, la cantidad de precursor proteolíticamente sin procesar no deseada y/o de polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado en preparaciones de neurotoxina está predefinida y, en la actualidad, bastante difícil de reducir.

El procesamiento de neurotoxinas se consigue también mediante la incubación del polipéptido precursor con un lisado de E. coli que contiene una actividad de proteasa provocada por una proteasa desconocida de E. coli que es capaz de escindir los polipéptidos de neurotoxina de manera que se obtienen polipéptidos maduros de doble cadena (véase el documento VV02006/076902).

El documento W02004/024909 divulga una neurotoxina botulínica que es capaz de activación y eliminación simultánea de una etiqueta de purificación.

El documento WO2010/124998, que pertenece al estado del arte según el Art. 54 (3), divulga una neurotoxina botulínica que contiene una secuencia enlazadora flanqueada por sitios de proteasa entre las cadenas ligera y pesada.

Los medios y métodos para una fabricación más eficiente de neurotoxinas mediante la reducción de la cantidad de polipéptidos de neurotoxina sin procesar y/o parcialmente procesados y por lo tanto mejorando la calidad de las preparaciones de neurotoxinas son altamente deseables, pero aún no se encuentran disponibles.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención puede verse como la provisión de medios y métodos para mejorar la fabricación de polipéptidos de neurotoxina mediante el cumplimiento de las necesidades anteriormente mencionadas. El problema técnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un polinucleótido que codifica un polipéptido de neurotoxina que comprende una cadena ligera, un enlazador y una cadena pesada, en donde el enlazador es un enlazador modificado que comprende una secuencia heteróloga de aminoácidos que confiere al menos una propiedad fisicoquímica al polipéptido que permite la separación de polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados y/o sin procesar de polipéptidos de neurotoxina procesados, estando dicha secuencia heteróloga de aminoácidos flanqueada en el terminal N y el terminal C por un sitio de reconocimiento y escisión de proteasa.

El término "polinucleótido" como se usa aquí se refiere a moléculas de ADN monocatenarias o bicatenarias, así como a moléculas de ARN. Abarcados por dicho término están ADN genómico, ADNc, ARNhn, ARNm, así como todos los... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de neurotoxina que comprende una cadena ligera, un enlazador y una cadena pesada, en donde el enlazador es un enlazador modificado que comprende una secuencia heteróloga de aminoácidos que confiere al menos una propiedad fisicoquímica al polipéptido que permite la separación de polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados o sin procesar de polipéptidos de neurotoxina procesados, siendo dicha secuencia heteróloga de aminoácidos flanqueada en el terminal N y C por un sitio de reconocimiento y escisión de proteasa, en donde la neurotoxina es una neurotoxina botulínica.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia heteróloga de aminoácidos se enlaza con alta afinidad a una matriz de purificación.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha secuencia heteróloga de aminoácidos que se enlaza con alta afinidad a una matriz de purificación comprende una etiqueta de purificación.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia heteróloga de aminoácidos aumenta el peso molecular del polipéptido de neurotoxina de tal manera que los polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados y/o no procesados pueden ser físicamente separados del polipéptido de neurotoxina procesado.

5. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde dicha secuencia heteróloga de aminoácidos que se enlaza con alta afinidad a una matriz de purificación comprende (i) al menos un dominio de aminoácidos que confiere alta afinidad de enlazamiento a la matriz de purificación y (¡i) al menos un dominio de aminoácidos que pone los residuos de cisterna que forman el puente disulfuro intramolecular entre la cadena ligera y pesada en forma muy próxima y/o previene la interferencia de la secuencia heteróloga de aminoácido con la formación de enlaces disulfuro adecuados entre la cadena ligera y pesada.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, en donde dicho al menos un dominio que confiere alta afinidad de enlazamiento con la matriz de purificación comprende una etiqueta de purificación.

7. El polinucleótido de la reivindicación 5 o 6, en donde dicho al menos un dominio de aminoácidos que evita la interferencia de la secuencia heteróloga de aminoácidos con la formación de enlaces disulfuro adecuados entre la cadena ligera y pesada forma una estructura tridimensional que pone los residuos de cisterna que forman el puente disulfuro intramolecular entre la cadena ligera y pesada en proximidad física.

8. El polinucleótido de la reivindicación 7, en donde dicha estructura tridimensional formada por los aminoácidos del terminal C y N de la secuencia heteróloga de aminoácidos es una bobina en espiral antiparalela o una estructura de lámina beta antiparalela.

9. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicha secuencia heteróloga de aminoácidos que se enlaza con alta afinidad a una matriz de purificación comprende además al menos una secuencia de aminoácidos marcadora detectable.

10. El polinucleótido de la reivindicación 9, en donde dicha secuencia de aminoácidos marcadora detectable se selecciona de entre el grupo que consiste de: una secuencia de aminoácidos de una proteína fluorescente, una secuencia de aminoácidos de una enzima capaz de generar una señal detectable, y una secuencia de aminoácidos de una etiqueta detectable.

11. El polinucleótido de la reivindicación 3 o cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde dicha etiqueta de purificación se selecciona de entre el grupo que consiste de: etiqueta de His, etiqueta de Myc, etiqueta FLAG, etiqueta de estreptavldina, etiqueta de MBP, etiqueta de NusA, etiqueta de GST, estreptavldlna y avldlna.

12. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho sitio de reconocimiento y escisión de proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste de: el sitio de reconocimiento y escisión de proteasa de cadena ligera de neurotoxina de SNAP 25, el sitio de reconocimiento y escisión de una proteasa de E. coli, el sitio de reconocimiento y escisión de tromblna, el sitio de reconocimiento y escisión del Factor X, el sitio de reconocimiento y escisión de la tripsina, el sitio de reconocimiento y escisión de la enteroqulnasa, el sitio de reconocimiento y escisión de la proteasa TEV, el sitio de reconocimiento y escisión de FIRV 3c y el sitio de reconocimiento y escisión de la proteasa PreScIssIon.

13. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha cadena ligera y pesada del polipéptido de neurotoxina son la cadena ligera y pesada de una neurotoxina seleccionada de entre el grupo que consiste de: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/CI, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT.

14. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o el vector de la reivindicación 14.

16. La célula anfitriona de la reivindicación 15, en donde dicha célula anfitriona es una célula bacteriana.

17. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. Un método para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina procesado que comprende las etapas de:

a) poner en contacto el polipéptido de neurotoxina sin procesar de la reivindicación 17 con una matriz de purificación bajo las condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir el enlazamiento de dicho polipéptido de neurotoxina sin procesar a la matriz de purificación;

b) poner en contacto el polipéptido de neurotoxina no procesado enlazado a la matriz de purificación con una proteasa que es capaz de escindir el polipéptido de neurotoxina en los sitios de reconocimiento y escisión de la proteasa dando como resultado polipéptidos de neurotoxina procesados y parcialmente procesados y/o no procesados; y

c) remover el polipéptido de neurotoxina procesado liberado de la matriz de purificación.

19. Un método para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina procesado que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un polipéptido de neurotoxina de la reivindicación 17 con una proteasa que es capaz de escindir el polipéptido de neurotoxina en los sitios de reconocimiento y escisión de la proteasa;

b) poner en contacto el polipéptido de neurotoxina procesado, sin procesar y/o parcialmente procesado obtenido en la etapa a) con una matriz de purificación bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir el enlazamiento de dicho polipéptido de neurotoxina sin procesar y/o parcialmente procesado a la matriz de purificación; y

c) remover el polipéptido de neurotoxina procesado, liberado, de la matriz de purificación.

20. El método de la reivindicación 19, en donde la etapa a) se lleva a cabo en una célula anfitriona o un lisado de la misma que expresa el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y una proteasa que es capaz de escindir el polipéptido de neurotoxina en los sitios de reconocimiento y escisión de la proteasa.

21. Un método para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina procesado que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un polipéptido de neurotoxina de la reivindicación 17 con una proteasa que es capaz de escindir el polipéptido de neurotoxina en los sitios de reconocimiento y escisión de la proteasa;

b) someter el polipéptido de neurotoxina procesado, sin procesar y/o parcialmente procesado obtenido en la etapa a) a condiciones físicas durante un tiempo suficiente para permitir la separación física de los polipéptidos de neurotoxina parcialmente procesados o sin procesar de los polipéptidos de neurotoxina procesados; y

c) remover el polipéptido de neurotoxina procesado después de dicha separación física.