Expresión diferencial de alelos específicos de subgenoma en algodón y usos de los mismos.

Un promotor preferente de células fibrosas que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del siguiente grupo de secuencias de nucleótidos:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO 9 desde el nucleótido de la posición 465 hasta el nucleótido de la posición 2307;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con dicha secuencia de nucleótidos mencionada en a), en la que dicho promotor preferente de células fibrosas que comprende dicha secuencia de nucleótidos dirige la expresión génica más allá de 30 DPA en Gossypium hirsutum.

Expresión diferencial de alelos específicos de subgenoma en algodón y usos de los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la agricultura, más específicamente al uso de técnicas de biología molecular para modificar plantas productoras de fibras, en particular, plantas de algodón, y/o acelerar el cultivo de tales plantas que contienen fibras. Se proporcionan promotores vegetales con un perfil de expresión preferente de fibra. Además, los promotores están sometidos a regulación temporal.

Técnica anterior

El algodón proporciona gran parte de la fibra de alta calidad para la industria textil. La modificación de las características de las fibras de algodón para adaptarse mejor a los requisitos de la industria es un esfuerzo considerable en el cultivo por procedimientos clásicos o mediante la modificación genética del genoma de las plantas de algodón.

Aproximadamente el 90 % del algodón que se cultiva en el mundo es Gossypium hirsutum L., mientras que Gossypium barbadense supone aproximadamente el 8 %. Como en la mayoría de las plantas con flor, se cree que los genomas del algodón han Incurrido en uno o más eventos de pollploldización y han evolucionado por la unión de vahos genomas divergentes en un núcleo común. El mercado del algodón está dominado por las formas mejoradas de dos especies tetraploldes "AD", Gossypium hirsutum L. y Gossypium barbadense L. Se cree que los algodones tetraploides se formaron hace aproximadamente 1-2 millones de años, en el Nuevo Mundo, por hibridación entre un taxón materno de genoma "A" del Viejo Mundo parecido a Gossypium herbaceum y un taxón paterno de genoma "D" del nuevo mundo parecido a Gossypium raimondii o Gossypium gossypioides. Los taxones silvestres de Gossypium tetraploide AD y dlplolde de genoma A producen fibras hllables. En Asia se sigue cultivando y desarrollando una especie diploide de genoma A, Gossypium arboreum. Su pariente cercano y posible progenitor, la especie diploide de genoma A G. herbaceum también produce fibra hllable. Aunque las semillas de los diploides de genoma D son puberales, ninguna produce fibras hllables. No se han domesticado los taxones de ninguno de los demás genomas diploides de Gossypium reconocidos (B, C, E, F y G). La selección dirigida Intensa llevada a cabo por el ser humano ha producido se forma consistente algodones tetraploides AD que tienen un rendimiento mejor y/o mejores características de calidad en comparación con las variedades de cultivo diploides de genoma A. En el cultivo selectivo de G. hirsutum (AADD) se ha enfatizado el rendimiento máximo, mientras que en el de G. barbadense (AADD) se valoran sus fibras de mayor longitud, resistencia y finura (Jiang et al. 1998 - Proc Nati Acad Sci USA. 14 de abril de 1998; 95(8): 4419-4424).

Una fibra de algodón es una sola célula que se inicia en la epidermis del tegumento exterior de los óvulos en la antesis o justo antes. Posteriormente, las fibras se elongan rápidamente durante aproximadamente 3 semanas antes de cambiar a la síntesis intensiva de celulosa de la pared celular secundaria. Las células fibrosas se interconectan únicamente con la capa subyacente de la semilla en los extremos básales y la entrada de solutos, agua y otras moléculas se produce a través de los plasmodesmas o la membrana plasmática. Rúan et al. 2001 (Plant Cell 13: 47- 63) demostraron un cierre transitorio de los plasmodesmas durante la elongación de las fibras. Rúan et al. 2004 (Plant Physiology - Vol. 136: págs. 4104-4113) compararon la duración del cierre de los plasmodesmas entre distintos genotipos de algodón de diferentes longitudes de fibra y descubrieron una correlación positiva entre la duración del cierre de los plasmodesmas y la longitud de las fibras. Además, se presentaron pruebas microscópicas que demostraban la deposición de callosa y la degradación en la base de la fibra, que se correlacionan con la cronología del cierre y la reapertura de los plasmodesmas. Además, la expresión de un gen de (3-1,3-endoglucanasa (GhGlucI) en las fibras, que permite degradar la callosa, presentaba una correlación con la reapertura de los plasmodesmas en la base de la fibra.

En el documento W02005/017157 se describen procedimientos y medios para modular la longitud de las fibras en plantas productoras de fibras tales como el algodón mediante la modificación de la fase de elongación de las fibras como se describe en Rúan et al. 2001. La fase de elongación de las fibras se puede aumentar o disminuir al interferir con la deposición de callosa en los plasmodesmas en la base de las células fibrosas.

Además, sería interesante para la modificación de las fibras por ingeniería genética la presencia de promotores que se expresan de forma preferente o específica sólo en células fibrosas y/o que se expresan únicamente a partir de una fase del desarrollo de la fibra en particular.

El documento W02004/018620 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una quitinasa de algodón endógena y su promotor, que se expresan preferentemente en las fibras durante la deposición de la pared secundaria. También se desvelan el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico, una construcción de ADN que enlaza la molécula de ácido nucleico aislada con un promotor, la construcción de ADN incorporada en un sistema de expresión, una célula huésped, una planta o una semilla vegetal. El documento también se refiere a una construcción de ADN que enlaza el promotor aislado con un segundo ADN, así como sistemas de expresión, células

huésped, plantas o semillas vegetales que contienen la construcción de ADN. También se desvelan procedimientos para conferir resistencia a insectos y hongos, regular el contenido de las fibras en celulosa y procedimientos para expresar un gen de forma preferente en las fibras durante la deposición de la pared secundaria.

Sería útil contar con promotores alternativos que dirigieran la expresión génica de forma preferente y/o intensa en las fibras durante la deposición de la pared secundaria, es decir, de forma intensa y continua (por ejemplo, a >50 % de su actividad máxima) por ejemplo, desde el inicio de la deposición de la pared secundaria hasta su finalización o, por ejemplo, de la fase de maduración en adelante. El inicio de la deposición de la pared secundaria se define como el momento en que comienza a aumentar el peso en seco por unidad de longitud de una fibra de algodón o en el que comienza a aumentar el peso seco por unidad de área de superficie de cualquier célula a través de la síntesis de un nuevo material de pared que contiene más del 40 % (p/p) de celulosa. En el caso de la fibra de algodón de G. hirsutum L., se espera que esto ocurra entre 14 y 17 DPA cuando se cultivan las plantas de algodón en condiciones típicas en el invernadero o en el campo (temperatura diurna de 26-34 °C, temperatura nocturna de 20-26 °C, intensidad lumínica mayor o igual a 1000 einstein/m2/s, con agua y nutrientes minerales adecuados). El final de la formación de la pared celular secundaria y el comienzo de la fase de maduración se suelen producir alrededor de 35 DPA en el caso de la fibra de algodón de G. hirsutum L.

Además, sería útil contar con promotores alternativos que dirigieran la expresión génica únicamente o de forma preferente en las fibras al mismo tiempo que excluyen o minimizan la expresión en otros tejidos.

Las invenciones descritas de aquí en adelante en el presente documento en los diferentes modos de realización, ejemplos, figuras y reivindicaciones proporcionan promotores o regiones promotoras específicos(as) de fibras y/o preferentes de fibras.

Sumario de la invención

En un modo de realización de la invención, se proporciona un promotor preferente de células fibrosas que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del siguiente grupo de secuencias de nucleótidos:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO 9 desde el nucleótido e la posición 465 hasta el nucleótido de la posición 2307;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de nucleótidos mencionada en a) en la que dicho promotor preferente de células fibrosas que comprende dicha secuencia de nucleótidos dirige la expresión génica más allá de 30 DPA en Gossypium hirsutum.

En otro modo de realización más de la invención, se proporciona un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN enlazadas de forma funcional

a) un promotor preferente de células fibrosas como se describe en el presente documento;

b) una región heteróloga... [Seguir leyendo]

1. Un promotor preferente de células fibrosas que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del siguiente grupo de secuencias de nucleótidos:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO 9 desde el nucleótido de la posición 465 hasta el nucleótido de la posición 2307;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con dicha secuencia de nucleótidos mencionada en a), en la que dicho promotor preferente de células fibrosas que comprende dicha secuencia de nucleótidos dirige la expresión génica más allá de 30 DPA en Gossypium hirsutum.

2. El promotor preferente de células fibrosas según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO 9 desde la posición 1374 hasta la posición 2307.

3. Un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN enlazadas de forma funcional

a) un promotor preferente de células fibrosas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2;

b) una región heteróloga de ADN que codifica un ARN biológicamente activo de interés; y

c) una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación.

4. El gen quimérico según la reivindicación 3, en el que dicha región de ADN heterólogo codifica una molécula seleccionada de entre una N-acetilglucosamina transferasa, preferentemente una N-acetilglucosamina transferasa de tipo NodC, una celulosa sintasa, una sacarosa sintasa, preferentemente una sacarosa sintasa de tipo C; una sacarosa fosfato sintasa; una (3-1,3-endoglucanasa, cslF, csID y una 1,3-1,4 glucano sintasa csIC.

5. El gen quimérico según la reivindicación 3, en el que dicho ARN biológicamente activo es una ribozima, un microARN, una horquilla de ARN bicatenario.

6. Una célula vegetal que comprende un gen quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una planta que comprende en sus células un gen quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

8. La planta según la reivindicación 7, que es una planta de algodón.

9. Una semilla de una planta que comprende en sus células un gen quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

10. Un procedimiento para expresar un ARN biológicamente activo de forma preferente en una célula fibrosa de una planta productora de fibras, tal como una planta de algodón, procedimiento que comprende

a) dotar a las células de dichas plantas de un gen quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; y

b) cultivar dichas plantas.

11. Uso de un promotor preferente de células fibrosas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la expresión preferente de un ARN biológicamente activo en células fibrosas de una planta productora de fibras.