Estabilidad de la producción masiva de metabolitos secundarios mediante cultivos sincronizados de células vegetales.

Un método para aislar una línea celular de una planta, en el que la línea celular aislada de la planta se caracteriza por que (i) procede de un cambium de la planta,

(ii) es homogénea, (iii) no ha experimentado desdiferenciación para formar el callo, comprendiendo el método:

(a) recoger un tejido que contiene el cambium de la planta;

(b) cultivar el tejido que contiene el cambium, induciendo de esta forma una capa proliferada del cambium a partir del cambium; y

(c) recoger las células que tienen continuidad meristemática del meristemo primario sin pasar por la desdiferenciación para obtener el callo aislando la capa de cambium.

Estabilidad de la producción masiva de metabolitos secundarios mediante cultivos sincronizados de células vegetales

Campo técnico

Las plantas se han usado de forma muy importante no solo como suministro de alimentos, sino también como fuente de muchas sustancias químicas entre las que se incluyen agentes farmacéuticos, fragancias, colorantes, sustancias químicas agrícolas y tientes etc. Los compuestos activos biológicos producidos por plantas son principalmente metabolitos secundarios. Existe un gran interés en los metabolitos secundarios tales como alcaloides, alérgenos, aminoácidos, antraquinonas, agentes contra la leucemia, agentes antimicrobianos, agentes antitumorales, agentes antivíricos, enzimas, flavonoides, insecticidas, opiáceos, perfumes, pigmentos, vitaminas, y polisacáridos, etc., puesto que la mayoría de ellos actúan como sustancias activas fisiológicamente. De acuerdo con Zhong (22), existen aproximadamente 1. metabolitos vegetales secundarios conocidos y más del 25 % de las medicinas que se utilizan de forma práctica son sustancias derivadas de plantas. Cada año se descubren continuamente nuevos metabolitos secundarios.

En el método obtener dichos metabolitos, existen muchos problemas, tales como una difícil síntesis química a pesar de recientes desarrollos asombrosos de la química orgánica, la demolición de la naturaleza debido a la explotación y la contaminación ambiental y los cambios en el contenido de metabolitos y aumento en los costes de producción dependiendo de las condiciones de cultivo, como la estación, la región y el clima. Por tanto, existen continuos intentos de producir metabolitos secundarios mediante la técnica de cultivo in vitro que tiene la ventaja de mantener las condiciones ambientales externas adecuadas y una producción a gran escala incluso en un sitio pequeño.

Antecedente de la técnica

De acuerdo con la patente coreana 131, la producción de sustancias biológicamente activas mediante cultivo de células vegetales tiene más ventajas que la extracción directa de la planta. Se considera que el cultivo de células vegetales es un método óptimo de producción continua que no se ve afectado por el medio ambiente y para resolver problemas pendientes como la destrucción ecológica. Nail y Roberts (24), sin embargo, se ha indicado la velocidad de crecimiento lenta y la baja productividad del cultivo de células vegetales en la producción de metabolitos secundarios. Para resolver este problema, existen estudio para optimizar los medios, condiciones de cultivo, procesos y consecución de mayor productividad etc. (Zhong 22). En la patente internacional W93/17121 se usaron varios medios para cultivar varios Taxus para conseguir un aumento en la tasa de crecimiento celular y productividad de paclitaxel. Basándose en los resultados de los experimentos, se indicaron condiciones para conseguir la producción masiva de paclitaxel. A pesar de las mejoras en la producción de los valiosos metabolitos secundarios, la variabilidad sigue siendo un problema importante de la producción de paclitaxel a partir de Taxus así como otras sustancias valiosas procedentes de numerosos sistemas vegetales.

La producción de metabolitos secundarios mediante cultivos de células vegetales a gran escala solo es comercialmente posible si se consigue un mantenimiento estable del crecimiento celular rápido y una elevada producción de metabolitos durante el cultivo a largo plazo. La capacidad de las líneas celulares para producir diferentes metabolitos no es estable, lo que hace que las líneas celulares pierdan su productividad inicial mediante subcultivos; es evidente que el éxito y el fracaso dependen de como resolvamos estos problemas.

En un cultivo de células vegetales, aunque las células proceden de una planta, la productividad de un metabolito en cada línea celular es diferente e inestable. Por tanto, establecer las líneas celulares que tienen elevada productividad y estabilidad genética es lo más importante de todo.

Líneas celulares derivadas de células únicas y células múltiples.

Las líneas celulares vegetales derivadas de células únicas tienen menor variabilidad que las líneas celulares derivadas de múltiples células; esto da como resultado mayor productividad. En anteriores invenciones se usaron tallos, raíces, semillas, agujas y hojas como los mejores explantes para la inducción de líneas celulares. Estos tallos, raíces, semillas, agujas y hojas son tejidos compuestos por células con diferentes funciones y morfología. Los callos, las líneas celulares derivadas de estos tejidos no son de un tipo. Por tanto, existen limitaciones a los intentos de reducir la variación de la producción de los callos derivados de estos tejidos compuestos por múltiples células.

Agregación celular

Una de las características distintivas del cultivo de células vegetales es la agregación de las células. De acuerdo con la patente 364478, el diámetro de la célula vegetal es de 3-3 pm que es aproximadamente 3 veces

más grande que la célula animal. Puesto que las paredes de las células vegetales tienen tendencia a adherirse entre sí, no es posible obtener una suspensión que contenga solamente células individuales dispersas. La proporción y el tamaño de los agregados celulares varían de acuerdo con la variedad de la planta y el medio en el que crece el cultivo. Nail y Roberts indicaron que la agregación celular conduce a una diferencia en el entorno local entre el interior y el exterior de las células, que puede dar como resultado una heterogeneidad del cultivo y finalmente produce cambios en el crecimiento y en el metabolismo.

El fin del cultivo en suspensión es obtener células individuales puras. Para conseguir este objetivo, se usaron la filtración, la maceración, y el cultivo de protoplastos usando enzimas. Sin embargo, la filtración y la maceración no proporcionan células individuales puras completas. La técnica del cultivo de protoplastos, que elimina la pared celular, es el método más fiable para generar células individuales, pero la enzima utilizada en el cultivo de los protoplastos produce daños o roturas en la pared celular que producen cambios en la fisiología de la célula. Además, los metabolitos secundarios hidrófobos tales como paclitaxel se pueden almacenar en la pared celular, por lo que los cambios en la pared celular tienen una relación intensa con la productividad.

Asimismo, la agregación celular ha sido siempre un obstáculo importante para conseguir una medición precisa del crecimiento celular mediante ensayos de recuento y bioquímicos aplicados a las células individuales. De acuerdo con Nail y Roberts (24), si fuera posible el cultivo de una sola célula, está proporcionaría fácilmente información más rápidamente acerca del comportamiento de las unidades celulares en el cultivo, tales como la biosíntesis, almacenamiento, y degradación etc. de metabolitos secundarios.

Desdiferenciación

La línea celular desdiferenciada, que es el callo, muestra gran variabilidad en la producción de metabolitos secundarios debido a la variación somatoclonal. Los callos derivados de tejidos permanentes tales como hojas, tallos, raíces y semillas que están compuestos por células con funciones y morfología diferentes suelen mostrar cambios muy importantes incluso en microentornos ligeramente distintos debido al meristemo secundario formado mediante desdiferenciación. Debido a esta sensibilidad, Hirasuna et al.(1996) investigaron para identificar las condiciones de cultivo celular, especialmente la densidad celular inicial, el intervalo de subcultivo y la temperatura, para mantenerlos tan precisamente como fuera posible.

Escalado

Para producir metabolitos secundarios mediante cultivo de células vegetales para su comercialización es fundamental el escalado. Se ha aplicado tecnología de biorreactores para la producción masiva tras publicarse numerosos artículos y patentes que informaban acerca de la producción de metabolitos con éxito mediante cultivo celular a escala de laboratorio. De acuerdo con la patente 294, la aplicación de la tecnología de biorreactores para la producción masiva proporciona un ambiente de cultivo muy diferente del de un matraz a escala de laboratorio, lo que da como resultado una disminución en la velocidad de crecimiento y la productividad y cambios en los metabolitos. Cuando se aplica un biorreactor a la producción masiva, los cambios en la velocidad de crecimiento, productividad y metabolitos se han convertido en problemas para la comercialización de sustancias biológicamente activas mediante cultivo celular. En el escalado de los cultivos de células vegetales, se prefiere un biorreactor que reciba el aire mediante impulsión exterior... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar una línea celular de una planta, en el que la línea celular aislada de la planta se caracteriza por que (i) procede de un cambium de la planta, (ii) es homogénea, (iii) no ha experimentado desdiferenciación para formar el callo, comprendiendo el método:

(a) recoger un tejido que contiene el cambium de la planta;

(b) cultivar el tejido que contiene el cambium, induciendo de esta forma una capa proliferada del cambium a partir del cambium; y

(c) recoger las células que tienen continuidad meristemática del meristemo primario sin pasar por la desdiferenciación para obtener el callo aislando la capa de cambium.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido de la etapa (a) está esterilizado.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende aislar la capa de cambium de una capa de callo que procede de un tejido que se ha obtenido de la planta pero que no contiene cambium y que ha proliferado de forma irregular.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende cultivar el tejido en un medio que contiene auxina.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el medio contiene 1-3 mg/l de auxina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la planta es del género Taxus.

7. Células aisladas derivadas del cambium de una planta, comprendiendo las células aisladas las siguientes

características:

(a) más del 9 % de células en suspensión existen como células individuales;

(b) tienen morfológicamente múltiples vacuolas;

(c) crecen más rápido que la línea celular derivada de regiones salvo el cambium del mismo origen vegetal, y se cultivan de forma estable durante un tiempo prolongado;

(d) tienen baja sensibilidad al estrés de cizalla en un biorreactor; y

(e) están indiferenciadas de forma innata.

8. Las células aisladas de acuerdo con la reivindicación 7, en donde las células se obtienen de una capa que se ha derivado del tejido de una planta, comprendiendo el tejido un cambium de la planta y la capa que ha proliferado a partir del cambium del tejido y no que ha proliferado desde un callo originado en la planta.

9. Las células aisladas de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la planta es del género Taxus.

1. Las células aisladas procedentes de un cambium de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células aisladas tienen la capacidad de liberar 27-72 veces más paclitaxel que las células derivadas de un tejido que se ha obtenido del género Taxus pero que no contiene un cambium.

11. Un método para producir sustancias biológicamente activas derivadas de plantas, comprendiendo el método las etapas de:

(a) producir las sustancias activas por cultivo de las células aisladas de la reivindicación 7 en un medio; y

(b) recoger las sustancias activas.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el cultivo de la etapa (a) comprende recuperar un medio que se ha utilizado para cultivar dicho cultivo de células aisladas y después suministrar medio nuevo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la planta es del género Taxus, y el principio activo es paclitaxel.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el medio contiene al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste de jasmonato de metilo, fenilalanina y quitosano.

15. Un método para conservar una línea celular vegetal, comprendiendo el método crioconservar las células aisladas de la reivindicación 7.