Procedimiento para el diagnóstico de cánceres de mucosa oral y faríngea.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de cánceres en la cavidad oral y faringe mediante el uso de la espectroscopía Raman,

que comprende la cuantificación de las intensidades y áreas de una diversidad de las bandas Stokes del espectro y la definición y cálculo de índices que resultan de dividir las áreas de dos bandas diferentes. El diagnóstico se determina por proximidad de los valores de estos índices con los valores previamente obtenidos en células normales y en células cancerosas.

Procedimiento para el diagnóstico de cánceres en mucosa oral y faríngea

5 Antecedentes

Cánceres de cavidad oral y faringe

Cáncer de cabeza y cuello es un término amplio que abarca el grupo heterogéneo de cánceres

que se presentan en las vías aéreas superiores y el tracto digestivo. incluyendo la cavidad oral, la

10 faringe y la laringe. Más del 90% de estos cánceres se desarrollan en el epitelio escamoso de los

revestimientos de la mucosa, por 10 que se CODoce como carcinoma de células escamosas. Los

principales factores de riesgo para el desarrollo de estos carcinomas son la exposición al tabaco

yel consumo excesi vo de alcohol. Se estima que este tipo de cáncer constituye e16% del total y

es la sexta causa de muerte relacionada con el cáncer. La incidencia del cáncer oral en España es

1 S de aproximadamente 6-13 casos por cada 100.000 hombres/año y 1-2 casos por cada 100.000

mujeres/año. La tasa global a los 5 años de supervivencia es de alrededor de 50-60% y depende

principalmente de la etapa del tumor al moment.o del diagnóstico.

La histologia es actualmen te el método estándar para el diagnóstico de cánceres de la cavidad

20 oral y la orofaringe. Ésta examina la morfología, grado de diferenciación y el número de mitosis

presentes en la muestra. La precisión del método depende del muestreo apropiado de la lesión

de que se trate y la correcta interpretación p2ltológica. Junto con la histología, el tamaño, la

afectación de los ganglios linfáticos, invasión perineural, invasión vascular y metástasis a

distancia se tienen en cuenta con el fin de adaptar el tratamiento y decidir sobre la terapia

2S adyuvante. Estos factores se utilizan como predictores de la agresividad del tumor y la

probabilidad de rocurrencia. Hay un período en la transformación maligna o carcinogénesis, en

el que se definen las lesiones como pre-malignas. Éstas son la leucoplasia oral (OLK) ,

hiperplasia, displasia mucosa (leve a severa) [P. Holmstrup, P. Vedtofte, 1. Reibel, K. Stoltze,

Oral Oncol. 2006. 42, 461]. Con la creciente capacidad proliferativa de las células hiperplásicas,

30 el contenido y los tipos de ADN y ARN. proteínas y lípidos va a cambiar tanto cualitativa como

cuantitativamente, lo que induce variaciones espectrales de células y tejidos. Todos estos

cambios existen antes de que aparezcan las manifestaciones clínicas y patológicas Y. por tanto,

ofrecen la oportunidad para el diagnóstico precoz del cáncer de cavidad oral. La identificación

temprana y la delimitación de estas lesiones malignas, junto con una terapia eficaz son cruciales

35 para mejorar las tasas de supervivencia de la!; p:aciente.c;.

Hoy en día, existe la necesidad clínica de nuevas tecnologías para diagnosticar estos estadios tempranos de la enfermedad e incrementar la rapidez con la que un médico puede hacer el diagnóstico y prescribir el tratamiento apropiado. Técnicas ópticas tales como la espectroscopia de dispersión elástica, técnicas de fluorescen'cia, espectroscopia infrarroja y la tomografia de coherencia óptica han sido evaluados para la detección de tumores de cabeza y cuello (Amelink A, Kaspers OP, Sterenborg HJ, van der Wal JE, Roodenburg JL, Wities MJ: Non-invasive measurement ofthe morphology and physiology of oral mucosa by use of optical spectroscopy. Oral Oncol 2008, 44 (1) :65-71», (Arens e, Reussner D, Woenkhaus J, Leunig A, Betz es, Glanz H: Indirect fluorescence lar y ngoscopy :in the diagnosis of precancerous and cancerous lar y ngeal lesions. Eur Arch Otorhinolar y ngol 2007, 264 (6) :621-6) , (Vokes DE, Jackson R, Guo S, et al: Optical coherence tomography enhanced microlar y ngoscopy: preliminar y report of a non-contact optical coherence tomography system integrated with a surgical microscope. Ann Otol Rhinol Lar y ngol 2008, 117:538-547») . Entre ellos, la espectroscopia Raman ha mostrado un considerable potencial como herramienta de diagnóstico en el tracto aérodigestivo superior, así como en una gama de otros tejidos y órganos, incluyendo la vej iga, mama, hueso, pulmón, sangre, ganglios linfáticos, la laringe, estómago y colon.

Espectroscopia Raman La espectroscopia Raman es una técnica analítica de alta resolución cuyo principio se basa en la irradiación de un tejido diana con una luz láser monocromática y posterior registro de la luz dispersada inelásticamente, que constituye e] espectro Raman. Los espectros de muestras biológicas muestran una "huella digital" (fingerprint) característica que viene detenninada por el tipo de vibraciones moleculares específicas de los enlaces químicos, proporcionando así infonnación de la composición química o bioquímica de los tejidos. La región Stokes del espectro Raman, situada entre 500 y 2000 cm-l., se correlaciona con las vibraciones moleculares de importancia bioquímica; así pues, las estructuras y confonnaciones bioquímicas específicas del tejido nos brindan una oportunidad única para distinguir entre diferente~ tipo~ de tejidos. Dado que las enfermedades y otras anomalfas patológicas conducen a cambios químicos y estructurales, se observan cambios en los especlrOS de vibración que pueden ser utilizados como marcadores fenotípicos, sensibles de la enfennedad. La e.<;;pectTO~copia Raman no requiere una preparación especial de la muestra ni marcadores, la presencia de agua no distorsiona el análisis, la adquisición del espectro es rápida y la intensidad de banda Raman es directamente proporcional a la concentración.

En la última década se han dado importantes avances tecnológicos en espectrometría y técnicas de computación que han permitido avanzar dc fonna significativa cn la espectroscopia Raman aplicada a las ciencias biológicas y de la vida [OC de Veld OC, Bak.ker Schut Te, Skurichina M, Witjes MJ, Van der Wal JE, Roodenburg JL, Sterenborg HJ. Lasers Med Sci 2005,

(4) :203-91. [N Stone, MSc (Dist.) ; Pela Stavroulaki, MD; Catherine Kendall, MSc (Oíst.) ; Martin Birchall, MD;Hugh 8arr, MD (Díst.) . L.ar y ngoscope, 1 la: 1 756 -1763, 20001 [Harris AT, Garg M, Yang XB, Fisher SE, Kirkham J, Srnith DA, Martin-Hirsch DP, High AS: Raman spectroscopy and advanced mathematical mndellíng in the discrimination of human thyroid cell lines. Head Neck Oncol 2009, 1 (1) : 38) . Se ha demostrado que el registro de los espectros Raman se puede realizar "in vitro" y "ex vivo" sin perturbar el entorno celular. Además, la técnica es capaz de detectar alteraciones mínimas en la composición bioquímica de las células vivas con el fin de producir una huella dactilar molecular para el diagnóstico del tejido diana.

La espectroscopía Raman en oncología En oncología, la espectroscopia Raman se está investigando como una herramienta de diagnóstico para caracterizar los cambios malih'llos tempranos. Aunque los estudios clínicos en la cabeza yel cuello son escasos, [Vi Li, Zhi-Ning Wen, Long-Jiang Li, Meng-Long Lí, Ning Gao and Yan-Zhi Guo, J. Raman Spectrosc. 2010, 41, 142-147J demuestran en su publicación que la diferencia en los espectros entre la mucosa nonnal y el"carcinoma es sutil pero los valores de sus variaciones son estadísticamente significativas. La comparación de los espectros Raman mostró un aumento de intensidad en las bandas Raman asociadas a las proteínas y el contenido de ADN, vinculadas ambas a la cancerización. Por su parte, investigadores del Hospital Universitario de Groningen [de Veld 2005. vide supra) publicaron un esrudio con 37 pacientes con lesiones de la mucosa oral, mostrando variaciones claras entre diferentes capas de células (capa de tejido conectivo frente a queratina I epitelio) . El grupo de Investigación Bi%tónica en el Hospital Royal Gloucesters/¡ire [G Shetty, e Kendall, N Shepherd , N Stone, H Barr. Br J Cancer 2006, 94 (10) : 1460-4] demostró que la espectroscopía Raman es una técnica muy sensible y específica para la identificación de los cambios bioquímicos en la carcinogénesis del esófago de Barrett. Ya en el año 2000, Stone e.t al. (Stone 2000. vide supra] examinaron el uso de espectroscopia Raman cn la detección de tumores malignos de laringe a partir de quince muestras de pacientes de distintas edades (18 a 79 años) . Estos autores pudieron analizar por Raman tres tipos de muestras (carcinoma de células nonnales, displásicas y de células escamosas) , con unas sensibilidadcs entre 76 y 92%, dependiendo del tipo de tejido examinado, y detenninaron que las diferencias espectrales están asociadas a variaciones en el ADN, aminoácidos, colágeno y glicolípidos. Recientemente, Wen-Liang Jo et al (Wen-Liang Lo, JianYun Lai, Stt=phtm ·E. Feinberg, Kenji lzumi, Shou-Yen Kao, Che-Shoa Chang, Alan Lin and Huihua Kenny Chiang. 1. Raman Spectrosc. 2011 , 42, 174-178.)... [Seguir leyendo]

l. Procedimiento in vitro y ex vivo para el diagnóstico de carcinoma epidennoide de mucosa oral y faríngea que compr'ende las siguientes elapas ; a) irradiación de tejido de células epiteliales con una luz láser comprendida en los rangos ultravioleta, infrarrojo o visible y registro del espectro Raman en el rang.

95. 1800 cm'l, b) cuantificación de las intensidades y áreas de las bandas Stokes del espectro Raman, e) calcular índices relativos que resultan de dividir las áreas de dos bandas diferentes, d) detenninar el diagnóstico por pr"oximidad de los valores de estos índices con los valores previamente obtenidos en células nonuales y en células cancerosas.

2. Procedimiento ill vi/ro y ex vivo para el diagnóstico de carcinoma epidennoide de mucosa oral y faríngea por medio de espectroscopia Raman, según reivindicación 1, caracterizado por: -identificar y cuantificar en la etapa b) las áreas de las bandas de Stokes asociadas a la fenilalanina (1003 cm-I) , amida 111 (1200-1400 em·l ) , amida 1 (1665 cm-I) y grupos C-H (1450 cm-') . -definir y calcular los siguientes índices en la etapa e) :

Índice P (proteínico) = área banda amida 111 / área banda grupos eH Índice F (fenilalanínico) = área banda amida III I área banda fenilalanina Índice L (Iipídico) = área banda fenilalanina / área banda amida 1

3. Procedimiento in vitro y ex vivo para el diagnóstico de carcinoma epidermoide de mucosa oral y faríngea por medio de espectroscopia Raman, según reivindicaciones 1-2, caracterizado por el hecho de que las etapas a) a d) son implementadas por ordenador.

4. Procedimiento in vi/ro y ex vivo para el diagnóstico de de carcinoma epidermoide de mucosa oral y faríngea, según reivindicaciones 1-3 caracterizado por comprender además una etapa previa de preparación de la muestra.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1-4 para el diagnóstico de diferentes estadios de neoplasias de carcinoma epidennoide de mucosa oral y faríngea.