DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR Y MÉTODO DE CONSTRUCCIÓN DEL MISMO.

Dispositivo analítico inmunosensor y método de construcción del mismo basado en la deposición secuencial de monocapas de polímeros y elementos de afinidad,

creando arquitecturas sensoras autoensambladas, constituyendo una superficie transductora cubierta por monocapas de polímeros (redox o no redox) sobre la que se depositan submonocapas de elementos de afinidad de anticuerpo, para posteriormente realizar la reacción de afinidad con un inmunoconjugado marcado con un trazador que es una enzima (redox o no redox). La señal se puede transducir de manera electroquímica, óptica, y/o piezoeléctrica.

Dispositivo analítico inmunosensor y método de construcción del mismo OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención, tal como expresa el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a un dispositivo analítico inmunosensor y al método de construcción de dicho dispositivo.

Más en particular, el objeto de la invención se centra en un dispositivo analítico inmunosensor basado en la deposición secuencial de monocapas autoensambladas de polímeros y elementos de afinidad, aplicable para la detección y cuantificación de cualquier analito o antígeno diana en una muestra líquida, y que hace posible realizar el ensayo por desplazamiento, minimizar la adsorción no específica y disminuir por tanto el límite de detección, para todo lo cual dicho dispositivo se configura a partir de una superficie transductora cubierta por monocapas de polímeros (redox o no redox) sobre la que se depositan submonocapas de elementos de afinidad, para posteriormente realizar la reacción de afinidad con un inmunoconjugado marcado con una enzima o proteína (redox o no redox), permitiendo dicho método de construcción del dispositivo desarrollar inmunosensores a la carta, al poder transducir la señal de manera electroquímica, óptica, y/o piezoeléctrica.

CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El campo de aplicación de la presente invención se enmarca dentro del sector de la industria dedicada a la fabricación de dispositivos analíticos, estando especialmente centrado en el ámbito de los sensores, sondas, sistemas y métodos de detección y cuantificación de analitos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Como es sabido, los sensores e inmunosensores constituyen dispositivos de análisis que se configuran como una herramienta analítica fiable y sencilla que, además, presenta la ventaja de ser barata, portátil, selectiva, de fácil manejo y que requiere de pocos microlitros de muestra para determinar un parámetro concreto.

De manera general un sensor o biosensor químico es cualquier dispositivo miniaturizado capaz de responder de manera inequívoca a un analito concreto en el seno de una muestra compleja. Consta, esencialmente, de dos partes: el elemento de reconocimiento que interactúa con el analito y concede selectividad al sensor, y el transductor que permite convertir esa interacción en una señal analítica.

Por su parte, un inmunosensor es un biosensor en el cual el componente biológico es un inmunorreactivo. Generalmente el elemento objetivo es el antígeno (el analito o el hapteno) y el anticuerpo se adhiere al transductor, aunque en algunos casos se obtiene una mejor respuesta cuando el analito, o una forma modificada de él, se adhiere al transductor.

Recientemente el diseño de los biosensores se ha visto implementado por la incorporación de la microelectrónica, las nanotecnologías y los biomateriales mejorando así sus características analíticas y dando lugar una herramienta clave en aquellos casos donde se requiera una toma de decisiones rápida.

La posibilidad de ofrecer información a tiempo real, su sencillez, su uso por personal no especializado y su capacidad para la monitorización en el tiempo, son características que están proporcionando claras ventajas sobre herramientas analíticas convencionales.

En este sentido, se necesitan sistemas versátiles que puedan ser diseñados "ad hoc, y por tanto permitan una sencilla implantación. Los (bio)sensores construidos sobre plataformas heterofuncionales permiten identificar y cuantificar compuestos de diferente naturaleza, utilizando elementos de biorreconocimiento en combinación con diferentes técnicas de transducción e integración de las señales obtenidas.

Entre dichas técnicas destaca la técnica capa por capa (LbL "Layer-by-layer"), que es una técnica en la que las películas se forman depositando capas alternas de materiales de carga opuesta con pasos de lavado intermedios. Las bicapas y los pasos de lavado se pueden realizar de muchas maneras diferentes, incluyendo el recubrimiento por inmersión, recubrimiento por rotación, recubrimiento por pulverización y técnicas de flujo. Las ventajas que ofrece sobre otros métodos de deposición de película delgada es que es extremadamente simple y barata. Hay una amplia variedad de materiales que pueden ser depositados por LbL incluyendo poliiones, metales, cerámicas, nanopartículas y moléculas biológicas. Otra cualidad importante de LbL es el alto grado de control sobre el grosor, que surge debido al crecimiento lineal de las películas con el número de bicapas. Ya que cada bicapa puede ser del orden de unos pocos nm, este método ofrece un fácil control sobre el espesor de la estructura.

El objetivo de la presente invención es, pues, el desarrollo de un método para la construcción de un dispositivo analítico que describe la incorporación de elementos de detección y soporte, mediante su inmovilización física creando una interfase tridimensional. Esta arquitectura sensora objeto de la presente invención permitirá, por ejemplo, la detección de sustancias de interés en el campo agroalimentario, biosanitario y medioambiental con cualquier tipo de

transducción.

Como referencia al estado de la técnica, debe mencionarse la existencia de diferentes registros de patente que divulgan dispositivos analíticos del tipo que aquí concierne, siendo los más próximos los siguientes:

- Patente US 2002/0137193 A1 26.09.2002 que hace referencia a un sistema de ensayo para la detección de una reacción de afinidad de una pareja de ligando-receptor (primer componente y segundo componente), el cual consiste en revestir el electrodo con un polímero redox reticulado que contiene un agente de unión, un sustrato que genera una enzima, (ambos unidos covalentemente al hidrogel redox) y el primer componente de la pareja receptor-ligando. El complejo que se forma, genera una señal eléctrica cuando se aplica un potencial al electrodo, de manera que la señal eléctrica generada se encuentra relacionada con la presencia o cantidad del segundo componente en la muestra. El primer componente se encuentra inmovilizado en un polímero redox sobre el electrodo. El polímero redox puede ser un polímero de poli(vinil piridina) (poly (4-vinyl pyridine). Además dichos polímeros redox se pueden encontrar formando complejos con metales de transición tales como osmio.

- Patente US 5534132 A 09.07.1996 que describe un biosensor amperométrico para la detección de reacciones de afinidad. Se trata de un electrodo que tiene su superficie sustancialmente cubierta con una lámina de traducción que comprende un hidrogel polímero tridimensional en el que se encuentra inmovilizada una unidad de unión (SBU, selective binding unit) o su complementaria. El agente de unión selectivo sirve para introducir el componente complementario marcado con la enzima redox en el hidrogel, generándose, de este modo, una respuesta amperométrica a través de una reacción de reducción/oxidación electrocatalítica del sustrato de enzima y una transducción de la actividad enzimática redox a través del hidrogel al electrodo. Los polímeros redox utilizados en dicho documento son, entre otros, polímeros derivados de poli(vinil piridina) con complejos de osmio cuaternizados con bromuro de bromoetilamina, para formar un polímero redox reticulable hidrofílico.

El documento PN - US2007092973 A1 divulga un film sensor de magnesio formado por un indicador, una sal cuaternaria de amonio, fosforo o imidazol, un surfactante y un ácido. Entre los compuestos químicos que divulga la invención, se encuentra el polímero de carga positiva polietilenimina, y varios agentes de entrecruzamiento derivados de los poli etilenglicoles.

El documento PN - WO0130495 A1 divulga una resina de cambio iónico donde aparecen como agentes de entrecruzamiento de superficie el etilenglicol diglicidil éter y la polietilenimina entre otros. Sin embargo, no se menciona su utilización como sensor

amperométrico para la detección de iones magnesio.

Además, como publicaciones de literatura científica, cabe mencionar la existencia de los siguientes documentos:

Reagentless biosensors based on self-deposited redox polyelectrolyte- oxidoreductases architectures. ARANTZAZU NARVAEZ ET AL. BIOSENSORS & BIOELECTRONICS vol. 15, 2000, páginas 43-52, en el que se describen biosensores basados en la autodeposición de polielectrolitos mediante la técnica LbL (layer-by-layer) sobre la superficie de un electrodo de oro cargado negativamente. Se utiliza también un polímero redox basado en Os.

Electrostatic assemblies for bioelectrocatalytic and bioelectronic applications. ELENA DOMINGUEZ ET AL. ELECTROANALYSIS vol 18, 2006, páginas 1871-1878, que trata sobre el uso de la tecnología...

1.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, aplicable para la detección y cuantificación de cualquier analito o antígeno diana en una muestra líquida, que siendo del tipo basado en la deposición de capas y/o monocapas de polímeros y elementos de afinidad sobre una superficie transductora, está caracterizado porque se configura a partir de una estructura polimérica que conforma una interfase sensora en la que se deposita una submonocapa de anticuerpo; porque dicho anticuerpo está unido por afinidad con el inmunoconjugado; y porque dicho inmunoconjugado, a su vez, está marcado por un trazador, permitiendo la detección del analito mediante ensayo por desplazamiento.

2.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según la reivindicación 1,

caracterizado porque el inmunoconjugado es un pseudo-antígeno o un antígeno modificado

marcado con un trazador.

3.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el trazador es una enzima o subunidad enzimática, una proteína no catalítica, un cromóforo, un fluróforo o un radioisótopo.

4.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según la reivindicación 3,

caracterizado porque la enzima o proteína es una BSA, HRP, Tirosinasa o una fosfatasa alcalina.

5.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según cualquiera de las

reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la estructura polimérica contiene un polímero redox con osmio, o rutenio o derivados del ferroceno como centros redox.

6.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según la reivindicación 5,

caracterizado porque la estructura polimérica conteniendo el polímero redox, incorporando un polímero de carga opuesta, se repite n veces.

7.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según cualquiera de las

reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la estructura polimérica contiene un polímero no redox catiónico ramificado o no, como la Polietilenimina, o cualquier polímero cuaternizado de poli(vinil piridina) con bromoetilamina.

8.- DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, según cualquiera de las

reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la superficie transductora es del tipo (X-CHy-S03-) dónde X es un grupo tiol, o un amino o un carboxílico e Y va del 1-6, como puede ser el MPS.

9.- METODO DE CONSTRUCCION DE UN DISPOSITIVO ANALÍTICO INMUNOSENSOR, tal como el descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende:

- La deposición de multicapas de polímeros de carga opuesta, para lo cual se produce la quimiosorción de un mercaptoderivado cargado negativamente, en la superficie de una superficie transductora.

- Sobre esta monocapa se deposita un polímero catiónico (redox o no) poliaminado y/o derivados de poli(vinil piridina) (redox o no) que permite la deposición controlada de una submonocapa de anticuerpo, dando lugar a la interfase sensora.

- Posteriormente se realiza la incubación con el inmunoconjugado, el cual está marcado con una enzima que puede ser redox o no redox (peroxidasa, alcalino fosfatasa, tirosinasa, albúmina etc.).

10.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque el dispositivo se almacena en seco y refrigerado.

11.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque, para la detección del analito deseado, se realiza la incubación del sensor directamente con la muestra, donde el analito presente desplaza el inmunoconjugado previamente unido al anticuerpo, dando lugar a una señal microgravimétrica o un cambio de Unidades de Resonancia.

12.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque, para la detección del analito deseado, se realiza un lavado y la adición del sustrato, dando lugar a la producción de una señal óptica o electroquímica.

13.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque el analito es detectado o cuantificado electroquímicamente, siendo la estructura polimérica un polímero redox, el trazador una peroxidasa y el sustrato H2O2.

14.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque el analito es detectado o cuantificado mediante balanza de Cristal de cuarzo, cuando la estructura polimérica es un polímero redox o no redox catiónico, y el trazador es una enzima o proteína.

15.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque el analito es detectado o cuantificado mediante SPR, cuando la estructura polimérica es un polímero redox o

no redox catiónico, y el trazador es una enzima o proteína.

16.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque el analito es detectado o cuantificado mediante trasducción óptica, cuando la estructura polimérica es un

polímero redox o no redox catiónico y el trazador es una proteína (peroxidasa o fosfatasa alcalina o Tirosinasa, un cromóforo, un fluoróforo o una nanopartícula.

17.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque, en la transducción electroquímica u óptica, comprende:

- Una incubación de una gota de muestra, pretratada o no, por un tiempo no inferior a 0,5 minutos, un lavado con agua y la adición de un sustrato apropiado al trazador.

18.- MÉTODO, según la reivindicación 9, caracterizado porque, en una detección 15 o cuantificación en tiempo real, mediante balanza de Cristal de Cuarzo o SPR, comprende:

- Una incubación de una gota de muestra, pretratada o no.