Procedimiento para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa.

Procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer,

que comprende la medición del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 en una muestra de plaquetas aisladas de una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer, y determinar si el nivel de la expresión está alterado en comparación con un control, en donde un incremento del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 cuando se compara con un control sano sin enfermedad indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10182499.

Solicitante: RANDOX LABORATORIES LTD..

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: ARDMORE, DIAMOND ROAD CRUMLIN, COUNTY ANTRIM BT29 4QY REINO UNIDO.

Inventor/es: ZELLNER,MARIA, OEHLER,RUDOLF.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/47 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
  • C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/68 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2534582_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades neurodegenerativas están creciendo considerablemente. Los datos sugieren que los problemas de salud neuronales se encuentran entre los que más contribuyen a la carga global de enfermedades e incapacidades.

Los marcadores diagnósticos de los trastornos nerviosos son especialmente importantes para el diagnóstico precoz en el curso de la enfermedad, cuando los compuestos terapéuticos tienen más posibilidades de actuar, pero el diagnóstico exacto es difícil. Existen pocos marcadores diagnósticos para las primeras etapas de los trastornos neuronales; los que están disponibles se basan en el análisis de un material muestreado (p. ej., líquido cefalorraquídeo) que se obtiene con dificultad e infligiendo dolor. Por lo tanto, es de gran importancia la caracterización de marcadores diagnósticos que sean detectables en la sangre periférica. Tales marcadores periféricos permitirían el cribado preventivo de una población de riesgo.

La enfermedad de Alzheimer es la causa principal de demencia en los países industrializados. En muy pocos casos se conocen unos antecedentes familiares claros, con mutaciones autosómicas sobre el gen del precursor de la proteína amiloide. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con enfermedad de Alzheimer no tienen antecedentes familiares obvios y se clasifican como enfermedad de Alzheimer esporádica. La causa de la enfermedad de Alzheimer esporádica permanece desconocida en su mayor parte (Blennow K. y VanMechelen E, J Neural Transm Suppl. 1998; 53: 223-35).

En la actualidad, la enfermedad de Alzheimer se diagnostica principalmente por exclusión de otras causas conocidas de demencia. El diagnóstico en una fase precoz antes de los cambios irreversibles es virtualmente inexistente. Sin embargo, el tratamiento farmacéutico es probablemente más eficaz en las primeras fases de la enfermedad, antes de que la neurodegeneración sea demasiado pronunciada y generalizada. Por lo tanto, hay una gran necesidad de marcadores diagnósticos mínimamente invasivos para el diagnóstico precoz de la evolución de la enfermedad.

Cattabeni et al. (2004. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psyquiatry 28(5): 763-770) enseñan que la plaquetas expresan y procesan el precursor de la proteína amiloide (APP, por su nombre en inglés) de una manera parecida a lo observado en el cerebro.

En la solicitud publicada de patente de los EE. UU. US 2003/0064411 se describe la expresión reducida de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada con el número de acceso de SwissProt P78417 en los tejidos encefálicos de los pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en la identificación de proteínas, aisladas de las plaquetas, que se pueden utilizar como marcadores para la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer comprende la medición del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 en una muestra de plaquetas aisladas de una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer y determinar si los niveles de expresión están alterados en comparación con un control, en donde un incremento del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S- transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 en comparación con un control sano sin la enfermedad indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer.

El diagnóstico implica el aislamiento de las plaquetas. En una realización preferida, las plaquetas no se deben activar durante la purificación de una muestra de sangre.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, el uso de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el kit comprende una sonda que permite la identificación de una proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 y los reactivos para un inmunoensayo, electroforesis bidimensional en gel o una reacción de la polimerasa para detectar el nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417.

Descripción de los dibujos

La invención se describe con referencia a los siguientes dibujos, en donde:

La figura 1 ilustra los niveles de activación celular para las plaquetas sin tratar, las plaquetas preparadas por cromatografía y las plaquetas preparadas por centrifugación; y

La figura 2 ¡lustra la técnica de la electroforesis diferencial en gel (DIGE).

Descripción detallada de la invención

Esta invención da a conocer procedimientos para diagnosticar la presencia, o el riesgo, de la enfermedad de Alzheimer basándose en la detección del nivel de expresión de una protelna especifica, que se expresa en las plaquetas de una persona que se sospecha que tiene la enfermedad. El nivel de expresión de la protelna en las plaquetas se determina fuera del cuerpo (ex vivo) de la persona que se sospecha que tiene la enfermedad, en un ensayo in vitro. La proteína que se puede detectar para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer se recoge en la tabla 1. La columna «% de cambio» representa el incremento o disminución (número negativo) de la expresión relacionado con la enfermedad en comparación con un control sin enfermedad.

Tabla 1. Marcadores de la enfermedad de Alzheimer

N.° de acceso de SwissProt*

Nombre de la proteína

Variante

pl calculado

MM

(kDa)

% de cambio EA/control

P78417

Glutatión S- transferasa col

Silvestre

6,19

30,2

* La base cognitiva de las proteínas de SwissProt es una base de datos de secuencias de proteínas anotadas establecida en 1986. La mantienen mediante colaboración el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y el Instituto de Bioinformática Europeo (EBI). La versión de SwissProt citada en la presente memoria es la v50.1, del 13 de junio de 2006. Se puede acceder a SwissProt en http://expasv.ch y en las páginas web del SIB y del EBI, www.isb-sib.ch y www.ebi.ac.uk . respectivamente. En Bairoch A. et al., Brief Bioinform. marzo de 2004; 5(1) 39-55 se ofrece una revisión de la base de datos SwissProt.

La tabla 1 indica el número de acceso de SwissProt para la proteína. Esto identifica el producto del ARNm que codifica la proteína.

La variante específica indicada en la columna 3 de la tabla 1 se utiliza de acuerdo con la invención. Más preferiblemente, la proteína tiene el pl (cuando se indica) y la masa molecular (MM) indicada en las columnas 4 y 5 de la tabla 1. La determinación de la MM de una proteína es un experimento convencional para el experto en la técnica, por ejemplo, se puede realizar mediante SDS-PAGE. La determinación del pl es también convencional para el experto en la técnica, mediante el uso de la técnica de ¡soelectroenfoque. El pl de la proteína en la tabla 1 se determinó mediante el programa informático de análisis bidimensional Decyder (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK).

El procedimiento requiere la detección del nivel de expresión de la proteína especificada a partir de las plaquetas de una persona, normalmente una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer o una persona que se cree que tiene una predisposición a la enfermedad. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «nivel de expresión» se refiere a la cantidad de la proteína especificada (o del ARNm que codifica la proteína) en las plaquetas muestreadas. A continuación, el nivel de expresión se compara con el nivel de expresión de la proteína a partir de las plaquetas de control. El control puede ser una muestra de plaquetas de una persona que se sabe que tiene la enfermedad o una muestra de una persona que se sabe que no tiene la enfermedad. Será evidente para el experto en la técnica que comparar los niveles de expresión de un control y de la muestra problema permitirá tomar la decisión de si el nivel de expresión... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende la medición del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 en una muestra de plaquetas aisladas de una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer, y determinar si el nivel de la expresión está alterado en comparación con un control, en donde un incremento del nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 cuando se compara con un control sano sin enfermedad indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la detección de la expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada del número de acceso de SwissProt P78417 se lleva a cabo en una muestra de plasma.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las plaquetas se purifican para estar sustancialmente libres de otros componentes de la sangre.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las plaquetas están sin activar.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de expresión en las plaquetas de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre Identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 se determina a partir de un extracto de proteínas plaquetarias.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en donde un extracto de proteínas plaquetarias se aísla de una muestra de sangre con un procedimiento que comprende las etapas de:

(i) retirar los glóbulos rojos y blancos de la muestra mediante sedimentación o centrifugación suave;

(ii) retirar las plaquetas de la muestra resultante;

(iii) poner en contacto las plaquetas obtenidas en la etapa (¡I) con un agente para Usar las plaquetas y precipitar el extracto de proteínas plaquetarias;

(iv) opcionalmente, centrifugar el lisado resultante para obtenerlas proteínas precipitadas.

7. Utilización de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer según un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el kit comprende una sonda que permite la identificación de una proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417 y los reactivos para un inmunoensayo, electroforesis bidimensional en gel o una reacción de polimerasa para detectar el nivel de expresión de la proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la sonda se fija específicamente a una proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la sonda es un anticuerpo o un aptámero.

10. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la sonda es un ácido nucleico que se híbrida a un ARNm que codifica una proteína de la glutatión S-transferasa de tipo silvestre identificada por el número de acceso de SwissProt P78417.


 

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