Derivados basados en ácido hialurónico, capaces de formar hidrogeles, método de preparación de los mismos, hidrogeles basados en dicho derivados, método de preparación de los mismos y uso.

Derivado basado en ácido hialurónico según la fórmula general (I)**Fórmula**

donde Ar es fenilo y R1 es etileno,

o Ar es indolo y R1 es etileno, o Ar es indolo y R1 es carboxietileno, y donde R2 es un alquilo que tiene de 3 to 7 átomos de carbono, y donde n está dentro del intervalo de 1 a 7.500.

Derivados basados en ácido hialurónico, capaces de formar hidrogeles, método de preparación de los mismos, hidrogeles basados en dicho derivados, método de preparación de los mismos y uso

Campo de la técnica

La invención se refiere a un nuevo derivado de ácido hialurónico que es adecuado para la preparación de hidrogeles, y un método de preparación del mismo. Además, esta se refiere a hidrogeles basados en dicho derivado, propiedades de los mismos, uso y método de preparación de los mismos.

Estado de la técnica

El hialuronano es un polisacárido que consiste en unidades de disacáridos compuestas por ácido D-glucurónico y N- acetil-D-glucosamina que se unen alternando enlaces glicosídicos (3-1,4 y (3-1,3. El peso molecular medio ponderal (si en lo sucesivo se menciona el peso molecular, será siempre el peso molecular medio ponderal) in vivo está dentro del intervalo de 3 kDa - 20 MDa. Es un polisacárido que es fácilmente soluble en un medio acuoso en el que forma disoluciones altamente viscosas, dependiendo de su peso molecular y concentración.

Los hidrogeles son materiales que se forman en agua mediante una red insoluble de al menos polímeros parcialmente hidrófilos1. Existen varias maneras de producir una red insoluble a partir de un polímero inicialmente hidrófilo. Es hidrofobización polimérica2 o el uso de un derivado de polímero soluble en agua que porta grupos funcionales reactivos que pueden tomar parte en otras reacciones químicas que llevan a la formación de una red polimérica 3-dimensional3"5

La preparación de derivados de hialuronano solubles y la siguiente reticulación de los mismos han sido descritas por diversos autores3'6. En el pasado, también se ha descrito el uso de derivados de fenol hialuronano para reacciones de reticulación y la preparación de hidrogeles. Calabro et al., 4,7,8 describen el método de preparación de derivados de fenol hialuronano por medio de una reacción de carboxilos que están presentes dentro de la estructura del ácido D-glucurónico de hialuronano con derivados de aminoalquilo de fenol. Esta reacción produce hialuronano amidas. La característica crucial para el procedimiento de dicha síntesis es la activación del carboxilo de hialuronano, para lo cual se usa la reacción con agentes deshidratantes de tipo carbodiimida (tal como EDC). El aminoalquil fenol más frecuentemente usado es tiramina6

En general, la reticulación de derivados de fenol hialuronano se inicia añadiendo una peroxidasa (tal como, la peroxidasa de rábano picante - HRP) y una disolución de peróxido de hidrogeno diluido. La peroxidasa de rábano picante (Horseradish peroxldase, HRP, E.C.1.1 1.1.7) se utiliza ampliamente en la actualidad como catalizador de reacciones orgánicas y de biotransformación9"13 Se caracteriza por una especificidad de sustrato muy amplia y por lo tanto, es capaz de oxidar varios compuestos tanto orgánicos como inorgánicos13'15

Es una enzima que comprende hierro que contiene hemo, como grupo prostético. El hierro tiene el grado de oxidación (III) en el estado no-activado de la enzima. La reacción con peróxidos lleva a la formación de un intermedio que se denomina HRP-I. El hierro hemo Fe(lll) se oxida a grupo oxiferrilo (Fe(IV)=0) y al mismo tiempo, se forma un radical catiónico tt en el ciclo de la porfirina. Dicha enzima activada es capaz de formar complejos con las moléculas del sustrato que, durante esta interacción, sufre una oxidation.14,16-18

La conversión de la enzima oxidada de vuelta a la forma inicial de la misma se realiza en dos etapas. En la primera etapa, tiene lugar una reacción entre la molécula del sustrato (S) y HRP-I, dando lugar al sustrato radical (R*) y a una forma parcialmente reducida de la enzima HRP-II. La HRP-II aún retiene el grupo oxiferrilo (Fe(IV)=0) pero ya no contiene el radical tt de la porfirina. Durante la transición de un electrón al radical porfirina un H+ es tomado al mismo tiempo por la proteína. La HRP-II se somete de nuevo a la reacción con el sustrato, dando lugar a R*. El grupo oxiferrilo (Fe(IV)=0) se reduce de vuelta a Fe(lll) durante esta reacción. Este proceso se asocia con la transferencia de 2 H+ al oxígeno del grupo oxiferrilo. Un protón se origina a partir del sustrato (o disolvente), la otra forma de proteína. Esto da como resultado la formación de una molécula de agua (Ecuación I y Esquema I).

Ecuación I: Descripción básica del mecanismo de catálisis de oxidación de sustrato por medio de HRP

Los radicales obtenidos del sustrato son capaces en varios casos de interactuar juntos, formando dímeros R-R. Este procedimiento ya no se ve afectado enzimáticamente y se asocia con la estabilidad y reactividad de los radicales resultantes. 14,1 '2S

Por lo tanto, en caso de una reacción de reticulación enzimática del derivado de fenol de polisacárido, el sustrato (ligando fenol - reactivo unido al polímero) es transformado por una enzima en un radical reactivo. Este radical puede luego reaccionar con otro radical fenol, formando ditiramina. Suponiendo una libre movilidad de la moléculas del sustrato (ligando) de la reacción enzimática y la consecución de la reacción copiando exactamente la Ecuación I, la enzima debería transformar gradualmente (siempre que se use una cantidad suficiente de peróxido) todas las moléculas de sustrato en radicales reactivos y estos deberían sufrir gradualmente dimerización (u oligomerización), si se proporciona un tiempo de reacción suficientemente largo. En caso de unir el sustrato (ligando) al polímero, el grado de reticulación del polímero debería alcanzar siempre el mismo valor, pese a que el tiempo para alcanzar este valor puede diferir dependiendo de la cantidad usada de enzima. Sin embargo, en la práctica es diferente. La bibliografía27 describe con detalle las relaciones entre la relación esperada de reticulación intramolecular e intermolecular y el peso molecular de los segmentos de polímero entre los sitios de reticulación (densidad de reticulación, la distancia entre los nudos de red), mientras que las interacciones intramoleculares que llevan a la reticulación se indican como no eficaces elásticamente, comparada con la reticulación intermolecular.

Además, se conoce a partir de la bibliografía que en el caso de usar los derivados fenólicos de ácido hialurónico (HA, del inglés hyaluronic acid), la cantidad de enzima afecta no sólo a la velocidad de la reacción de reticulación, sino que también afecta significativamente las propiedades mecánicas resultantes de los hidrogeles46728 La bibliografía establece que a través de mediciones Teológicas se ha encontrado que el módulo de cizalla (G1) es mayor si se usa una mayor concentración de la enzima. La causa de este fenómeno, según los autores, es una mayor densidad de reticulación de los hidrogeles. Si se desea preparar un hidrogel de máxima firmeza, la reacción de reticulación debe realizarse a una concentración relativamente alta de peroxidasa y, por lo tanto, también de forma más rápida. Sin embargo, realizar muy rápidamente la reacción puede llevar a la formación de un hidrogel reticulado no homogéneo. Como consecuencia, pueden aparecer sitios en las muestras que no se han reticulado en absoluto. Asimismo, realizar muy rápidamente la reacción también puede causar problemas a la hora de colocar el gel en el sitio de la aplicación final del mismo y similares.

La causa de esto es una pequeña distancia desde el centro activo a la cadena polimérica básica. La baja movilidad del ligando disminuye la probabilidad de una colisión eficaz de los radicales ligando para formar ditiramina. Por lo tanto, si hay una baja concentración de la enzima dentro del sistema, se puede formar una pequeña cantidad de formas de ligando reactivas en una unidad de tiempo. Así, la reacción de reticulación procede lentamente y es poco eficaz.

Park et al.,29 trataron de aumentar la reactividad de los ligandos unidos al polímero insertando un espaciador adecuado entre el ligando reactivo y la cadena polimérica. El documento describe la inserción de una cadena hidrófila entre la cadena de polisacárido y anillo de fenol o anilina, con el fin de aumentar la reactividad de estos sustitutos. El principal motivo de introducir la cadena hidrófila en la estructura... [Seguir leyendo]

1. Derivado basado en ácido hialurónico según la fórmula general (I)

donde Ar es fenilo y R1 es etileno, o Ar es indolo y R1 es etileno, o Ar es indolo y R1 es carboxietileno, y donde R2 es un alquilo que tiene de 3 to 7 átomos de carbono, y donde n está dentro del intervalo de 1 a 7.500.

2. Un método de preparación del derivado definido por la fórmula general (I), caracterizado porque primero se prepara un derivado aldehídico de ácido hialurónico, según la fórmula (II),

donde el derivado de aldehído se prepara usando el sistema de oxidación 4-acetamido-TEMPO/NaClO en un medio prótico y tiene el grado de sustitución de 5 - 15% y el peso molecular dentro del intervalo 10.000 g/mol a 2.000.000 g/mol,

donde Ar es fenilo y R1 es etileno, o Ar es indolo y R1 es etileno, o Ar es indolo y R1 es carboxietileno, y donde R2 es un alquilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, y donde n está dentro del intervalo de 1 a 7.500, en donde el compuesto según la fórmula general (III) se prepara por la reacción de un precursor espaciador según la fórmula (IV)

Z-NH-R2-COOH

(IV),

donde Z es un grupo protector que se usa comúnmente para la protección de un grupo amino primario, siendo el ligando según la fórmula (V)

en un medio aprótico a una temperatura en el intervalo de 40°C a 150°C, durante 1 a 24 horas, en presencia de un agente que activa los grupos funcionales carboxilo,

dando lugar al compuesto según la fórmula general (VI)

Z-N H- R2-C0- N H-R1 -Ar-OH

(VI),

a partir del cual se prepara el compuesto según la fórmula general (III) retirando el grupo protector Z, y a continuación se hace reaccionar el derivado aldehídico de ácido hialurónico según la fórmula (II) con el compuesto según la fórmula general (III) a un pH dentro del intervalo de 3 a 8, a temperatura ambiente durante 1 a 72 horas, en presencia del complejo picolin-borano dando lugar al derivado según la fórmula (I).

3. El método de preparación según la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando según la fórmula general (V) se selecciona del grupo que comprende tiramina, serotonina y 5-hidroxitriptofano.

4. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque el compuesto según la fórmula general (IV), es decir, el precursor espaciador, se selecciona del grupo de aminoácidos que comprende los derivados de ácidos w-[(terc-butoxicarbonil) amino] carboxílicos, donde R2es un alquilo que tiene de 3 to 7 átomos de carbono.

5. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la reacción del precursor espaciador con el ligando tiene lugar en un medio de THF o DMF, a la temperatura de 50°C, durante 2 a 6 horas, en presencia de 1,1, -carbodiimidazol.

6. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la retirada del grupo protector Z se realiza por medio de ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico.

7. Hidrogel basado en el derivado reticulado según la fórmula general (I)

donde Ar es fenilo y Ri es etileno, o Ar es indolo y Ri es etileno, o Ar es indolo y Ri es carboxietileno, y donde R2 es un alquilo que tiene de 3 to 7 átomos de carbono, y donde n está dentro del intervalo de 1 a 7.500.

8. Un método de producción del hidrogel definido en la reivindicación 7, caracterizado porque el derivado según la fórmula general (I) se trata con un generador de radicales fenoxi reactivos a un pH en el intervalo de 4 a 10.

9. El método de producción según la reivindicación 8, caracterizado porque el generador de radicales fenoxi reactivos se selecciona del grupo que comprende el sistema de peroxidasa de rábano picante y la fuente de radicales hidroxilo, donde la fuente de radicales hidroxilo puede ser una disolución de peróxido de hidrógeno en agua, o el sistema de oxldasa-oxígeno-sustrato, por ejemplo, galactosa oxidasa - galactosa o glucosa oxidasa - glucosa.

10. Un uso del hidrogel definido en la reivindicación 7 para la producción de preparaciones para cosméticos, medicina o medicina regenerativa.

11. El uso según la reivindicación 10 donde las preparaciones comprenden apósitos para curar heridas, barreras biodegradable que impiden la formación de coalescencias post-cirugía, preparaciones para el aumento de tejidos blandos, rellenos de defectos de tejido, matrices para la ingeniería de tejidos.

12. El uso según la reivindicación 10, donde las preparaciones comprenden matrices sembradas o no sembradas para el tratamiento de defectos de cartílago articular y defectos de huesos.

(I)

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