Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora.

Una célula hospedante de mamífero o de levadura modificada genéticamente para que exprese:

(i) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad manosidasa II (Man II); o

(ii) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III, al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad Man II y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad b(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnT II);

en donde la célula hospedante está modificada genéticamente para que exprese dichos ácidos nucleicos en una cantidad suficiente para modificar genéticamente los oligosacáridos en la región Fc de un polipéptido producido por dicha célula hospedante, en donde dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo que retiene una región Fc funcional y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, en donde dicho polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi, y en donde dicha célula hospedante de mamífero es una célula cultivada, o comprendida en tejido animal cultivado, o comprendida en un animal transgénico no humano.

Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la modificación genética de la glicosilación de proteínas. Más en concreto, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo constructos de fusión, que tienen actividad catalítica y al uso de éstas para la modificación genética de la glicosilación de células hospedantes para generar polipéptidos con mejores propiedades terapéuticas, incluyendo anticuerpos con mayor unión al receptor de Fc y mayor función efectora.

Antecedentes de la técnica Las glicoproteínas median en muchas funciones esenciales en los seres humanos, otros organismos eucariotas y algunos procariotas, incluyendo la catálisis, la señalización, la comunicación célula-célula, y el reconocimiento y la asociación molecular. Forman la mayoría de las proteínas no citosólicas en los organismos eucariotas (Lis et al., Eur.

J. Biochem., 218:1-27 (1993) ) . Muchas glicoproteínas se han aprovechado para fines terapéuticos, y durante las últimas dos décadas, las versiones recombinantes de glicoproteínas segregadas naturales han sido el producto principal de la industria biotecnológica. Los ejemplos incluyen la eritropoyetina (EPO) , los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb terapéuticos) , el activador del plasminógeno tisular (tPA) , el interferón-ß (IFN-ß) , el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , y la gonadotropina coriónica humana (hCG) (Cumming et al., Glycobiology, 1:115-130 (1991) ) .

El componente de oligosacárido puede afectar significativamente a las propiedades importantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la resistencia a ataques de proteasas, las interacciones con el sistema inmunológico, la farmacocinética y la actividad biológica específica. Estas propiedades pueden depender no sólo de su presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos. Pueden realizarse algunas generalizaciones entre la estructura de los oligosacáridos y la función de la glicoproteína. Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacáridos median en la rápida eliminación de la glicoproteína de la corriente sanguínea a través de interacciones con proteínas de unión a carbohidratos específicas, mientras que otras pueden ser unidas por anticuerpos y desencadenar reacciones inmunológicas no deseadas (Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996) ) .

Las células de mamífero son los hospedantes preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para la aplicación humana (Cumming et al., Glycobiology, 1:115-130 (1991) ; Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996) ) . Las bacterias muy raramente glicosilan proteínas, y al igual que otros tipos de hospedantes habituales, tales como células de levadura, de hongos filamentosos, de insecto y vegetales, producen unos patrones de glicosilación asociados con la rápida eliminación de la corriente sanguínea, interacciones inmunológicas no deseadas y, en algunos casos específicos, una menor actividad biológica. Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster chino (CHO) han sido las que se han utilizado más habitualmente durante las últimas dos décadas. Además de producir unos patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten la generación constante de líneas de células clónicas muy productivas y genéticamente estables. Éstas pueden cultivarse hasta densidades altas en biorreactores sencillos utilizando un medio exento de suero y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles. Otras células animales que se emplean de modo habitual incluyen las células de riñón de cría de hámster (BHK) , células de mieloma de ratón NS0 y SP/20. En fechas más recientes también se ha ensayado la producción a partir de animales transgénicos (Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996) ) .

Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada, poseyendo cada isotipo una disposición exclusiva de estructuras de carbohidratos N-enlazados, que afectan de modo variable al ensamblaje de las proteínas, su secreción o su actividad funcional (Wright, A., y Morrison, S.L., Trends Biotech., 15:26-32 (1997) ) . La estructura del carbohidrato N-enlazado unido varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos con múltiples ramificaciones y alto contenido en manosa, así como oligosacáridos complejos biantenarios (Wright, A., y Morrison, S.L., Trends Biotech., 15:26-32 (1997) ) . De forma característica, existe un procesamiento heterogéneo de las estructuras de los oligosacáridos centrales unidas en un sitio de glicosilación particular, de modo que incluso los anticuerpos monoclonales existen como múltiples glicoformas. De manera similar, se ha demostrado que se producen diferencias importantes en la glicosilación de anticuerpos entre las líneas celulares, e incluso se observan pequeñas diferencias en una línea celular concreta cultivada bajo diferentes condiciones de cultivo (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5 (8) :813-22 (1995) ) .

Los anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del cáncer, según ha sido demostrado por la aprobación por parte del U.S. Food and Drug Administration del rituximab (Rituxan; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA; y Genentech Inc., San Francisco, CA) para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano de células B CD20-positivo, de grado bajo o folicular, del trastuzumab (Herceptin; Genentech Inc.) para el tratamiento del cáncer de mama avanzado (Grillo-López, A. J., et al., Semin. Oncol., 26:66-73 (1999) ; Goldenberg, M.M., Clin. Then., 21:309-318 (1999) ) , del gemtuzumab (Mylotarg, Celltech/Wyeth-Ayerst) para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en recaída, y del alemtuzumab (CAMPATH, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de células B. El éxito de estos productos se basa no sólo en su eficacia sino también en sus extraordinarios perfiles de seguridad (Grillo-López, A. J., et al., Semin. Oncol., 26:66-73 (1999) ; Goldenberg, M.M., Clin. Then., 21:309-318 (1999) ) . A pesar de los logros de estos fármacos, actualmente existe un gran interés en obtener una actividad de anticuerpos específicos mayor que la se obtiene de modo típico con la terapia de mAb no conjugados.

Una manera de obtener un gran aumento en la potencia, manteniendo un proceso de producción sencillo y evitando potencialmente efectos secundarios no deseados y significativos, es potenciar las funciones efectoras naturales mediadas por células de los mAb modificando su componente de oligosacáridos (Umaña, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999) ) . Los anticuerpos de tipo IgG1, que son los anticuerpos que se emplean más habitualmente en la inmunoterapia del cáncer, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación N-enlazado conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 están escondidos entre los dominios CH2, formando contactos extensos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia es fundamental para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology, 5:813-822 (1995) ; Jefferis, R., et al., Immunol Rev., 163:59-76 (1998) ; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol., 15:26-32 (1997) ) .

Los presentes inventores han demostrado previamente que la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de ß (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) , una glicosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados, aumenta significativamente la actividad ADCC in vitro de un anticuerpo modificada (véase Umaña, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999) , publicación internacional n°WO 99/54342, cuyos contenidos completos se incorporan por la presente por referencia en su totalidad) . El anticuerpo chCE7 pertenece a una gran clase de mAb no conjugados que tienen una alta afinidad y especificidad de tumor pero que tienen una potencia demasiado pequeña para ser clínicamente útiles cuando se producen en líneas celulares industriales convencionales que carecen de la enzima GnTIII (Umaña, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999) ) . Este estudio fue el primero en demostrar que puede... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedante de mamífero o de levadura modificada genéticamente para que exprese:

(i) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de ß (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad manosidasa II (Man II) ; o (ii) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III, al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad Man II y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnT II) ; en donde la célula hospedante está modificada genéticamente para que exprese dichos ácidos nucleicos en una cantidad suficiente para modificar genéticamente los oligosacáridos en la región Fc de un polipéptido producido por dicha célula hospedante, en donde dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo que retiene una región Fc

funcional y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, en donde dicho polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi, y en donde dicha célula hospedante de mamífero es una célula cultivada, o comprendida en tejido animal cultivado, o comprendida en un animal transgénico no humano.

2. La célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante muestra afinidad de unión aumentada al receptor Fc como resultado de dicha modificación genética.

3. La célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido producido por dicha célula

hospedante muestra función efectora aumentada como resultado de dicha modificación genética. 25

4. La célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha función efectora aumentada es citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, unión a células NK aumentada, unión a macrófagos aumentada, unión a células polimorfonucleares aumentada, unión a monocitos aumentada, apoptosis inducida por señalización directa aumentada, maduración de células dendríticas aumentada o cebado de linfocitos T aumentado.

5. La célula hospedante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de manosidasa II, ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa I, manosidasa I, ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa II o 1, 6-fucosiltransferasa de núcleo.

6. Un método para producir un polipéptido en una célula hospedante de mamífero o de levadura, que comprende:

(i) cultivar una célula hospedante modificada genéticamente para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad ManII, y opcionalmente, al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnT II, en condiciones que permiten la producción de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo que retiene una región Fc funcional y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, en donde dicho polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III, dicho polipéptido que tiene actividad Man II y dicho polipéptido que tiene actividad GnT II se expresan en una cantidad suficiente para modificar genéticamente los oligosacáridos en la 45 región Fc de dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante, y en donde el polipéptido de fusión que tiene actividad GnT III comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi, y (ii) aislar dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha célula hospedante además se modifica genéticamente para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnT II.

8. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en el que dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de GnT III.

9. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de manosidasa II, ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa I, manosidasa I, ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa II o 1, 6-fucosiltransferasa de núcleo.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido tiene función efectora aumentada como resultado de dicha modificación genética.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante tiene una proporción aumentada de oligosacáridos bisectados, no fucosilados en la región Fc de dicho polipéptido.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos oligosacáridos bisectados, no fucosilados son híbridos o complejos.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %

o al menos un 35 % de los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido son bisectados, no fucosilados.