Conjugados transportadores de péptidos inmunogénicos y métodos para producirlos.

Método para conjugar un inmunógeno peptídico mediante un grupo reactivo de un resto aminoacídico del inmunógeno peptídico con un transportador proteico/polipeptídico que tiene uno o más grupos funcionales,

comprendiendo el método las etapas de:

(a) derivatizar uno o más de los grupos funcionales del transportador proteico/polipeptídico para generar un transportador derivatizado con sitios reactivos, en el que el transportador está seleccionado del grupo que consiste en CRM197, ORF1224 de Streptococcus pyogenes, ORF1664 de Streptococcus pyogenes, ORF2452 de Streptococcus pyogenes y ORF T858 de Chlamydia pneumoniae;

(b) hacer reaccionar el transportador proteico/polipeptídico derivatizado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un aminoácido del inmunógeno peptídico en condiciones de reacción tales que el inmunógeno peptídico se conjugue con el transportador proteico/polipeptídico derivatizado mediante los grupos funcionales; y

(c) hacer reaccionar adicionalmente el conjugado con N-acetilcisteamina para inactivar los grupos funcionales libres reactivos sin reaccionar en el transportador proteico/polipeptídico derivatizado, preservando así la funcionalidad del transportador, de manera que conserve su capacidad para inducir las respuestas inmunitarias deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera no se producirían sin un transportador, en el que el conjugado tiene la fórmula:**Fórmula**

en la que C es el transportador proteico/polipeptídico, Xd es un grupo funcional derivatizado del transportador proteico/polipeptídico, P es el inmunógeno peptídico, R es una molécula de protección, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esencia de la inmunidad adaptativa es la capacidad de un organismo para reaccionar ante la presencia de sustancias extrañas y producir componentes (anticuerpos y células) capaces de interaccionar específicamente con y proteger al hospedador frente a la invasión. Un "antígeno"o"inmunógeno" es una sustancia capaz de inducir este tipo de respuesta inmunitaria y también capaz de interaccionar con los anticuerpos y células sensibilizadas que se generan en su contra.

Los antígenos o inmunógenos son normalmente macromoléculas que contienen sitios antigénicos o "epítopos" distintos que son reconocidos e interaccionan con los diversos componentes del sistema inmunitario. Pueden existir como moléculas individuales compuestas por productos químicos sintéticos orgánicos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, ARN, ADN o polisacáridos, o pueden ser partes de estructuras celulares (bacterias u hongos) o virus (Harlow y Lane 1988a, b, c; Male et al., 1987) .

Las moléculas pequeñas tales como péptidos cortos, aunque normalmente capaces de interaccionar con los productos de una respuesta inmunitaria, con frecuencia no pueden inducir una respuesta por sí solos. Estos inmunógenos peptídicos o "haptenos" como también se denominan, son en realidad antígenos incompletos, y, aunque no son capaces por sí mismos de provocar la inmunogenicidad o inducir la producción de anticuerpos, pueden hacerse inmunogénicos acoplándolos a un transportador adecuado. Los transportadores son por lo general antígenos proteicos de mayor peso molecular que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria cuando se administran in vivo.

En una respuesta inmunitaria, los anticuerpos son producidos y secretados por los linfocitos B junto con los linfocitos T cooperadores (TH) . En la mayoría de los sistemas hapteno-transportador, los linfocitos B producen anticuerpos que son específicos tanto para el hapteno como para el transportador. En estos casos, los linfocitos T tendrán dominios de unión específicos en el transportador, pero no reconocerán al hapteno en solitario. En una especie de sinergia, los linfocitos B y T cooperan para inducir una respuesta de anticuerpos específica de hapteno. Después de producirse una respuesta inmunitaria de este tipo, si el hospedador es posteriormente provocado con sólo el hapteno, responderá normalmente produciendo anticuerpos específicos de hapteno a partir de células de memoria formadas después de la inmunización inicial.

Con frecuencia, haptenos sintéticos que imitan algunas estructuras epitópicas críticas en macromoléculas más grandes se conjugan con transportadores para crear una respuesta inmunitaria contra la molécula "parental" más grande. Por ejemplo, pueden sintetizarse segmentos de péptidos cortos a partir de la secuencia conocida de una proteína y acoplarse a un transportador para inducir inmunogenicidad contra la proteína nativa. Este tipo de enfoque sintético para la producción de inmunógenos se ha convertido en la base de gran parte de la investigación actual en la creación de vacunas. Sin embargo, en muchos casos, la mera creación de una respuesta de linfocitos B utilizando conjugados péptido-transportador sintéticos, aunque bien diseñados, no siempre garantizará la inmunidad protectora completa contra un antígeno intacto. La respuesta inmunitaria generada por un epítopo peptídico corto de una célula bacteriana o partícula viral más grande solamente puede ser suficiente para generar memoria a nivel de linfocitos B. En estos casos está generalmente aceptado actualmente que una respuesta citotóxica de linfocitos T es un indicador más importante de inmunidad protectora. El diseño de inmunógenos peptídicos con los sitios de unión epitópicos adecuados para el reconocimiento tanto de linfocitos B como de linfocitos T es una de las áreas de investigación en inmunología más desafiantes hoy en día.

El enfoque para aumentar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas o escasamente inmunogénicas conjugando estas moléculas con moléculas "transportadoras" grandes se ha utilizado con éxito durante décadas (véase, por ejemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53) . Por ejemplo, se han descrito muchas composiciones inmunogénicas en las que se han conjugado polímeros capsulares purificados con proteínas transportadoras para crear composiciones inmunogénicas más eficaces aprovechando este "efecto transportador" (Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591) . La conjugación también ha demostrado eludir la escasa respuesta de anticuerpos que suele observarse en lactantes cuando son inmunizados con un polisacárido libre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294) .

Se han generado con éxito conjugados hapteno-transportador utilizando diversos reactivos de entrecruzamiento/acoplamiento tales como entrecruzadores homobifuncionales, heterobifuncionales o de longitud cero. Se dispone en la actualidad de muchos de tales métodos para el acoplamiento de sacáridos, proteínas y péptidos a transportadores peptídicos. La mayoría de los métodos crean enlaces amina, amida, uretano, isotiourea o disulfuro, o en algunos casos tioéteres. Una desventaja con el uso de reactivos de acoplamiento, que introducen sitios reactivos en las cadenas laterales de las moléculas de aminoácido reactivas en las moléculas de transportador y/o de hapteno, es que si no se neutralizan los sitios reactivos, pueden reaccionar con cualquier molécula no deseada, ya sea in vitro (perjudicando así a la funcionalidad o la estabilidad del conjugado o conjugados) o in vivo (lo

que entraña un riesgo potencial de reacciones adversas en personas o animales inmunizados con las preparaciones) . Tales sitios reactivos en exceso pueden hacerse reaccionar o "protegerse (be capped) ", para inactivar estos sitios, utilizando diversas reacciones químicas conocidas, pero estas reacciones pueden ser perjudiciales de otro modo para la funcionalidad de los conjugados. Esto puede resultar especialmente problemático cuando se intenta crear un conjugado introduciendo los sitios reactivos en la molécula transportadora, ya que su mayor tamaño y estructura más compleja (con respecto al hapteno) pueden hacerla más vulnerable a los efectos perjudiciales del tratamiento químico. De hecho, no se conocen ejemplos de métodos mediante los que producir un conjugado activando en primer lugar el transportador, haciéndolo reaccionar a continuación con el hapteno en una reacción de conjugación y finalmente "protegiendo (capping) " los sitios reactivos restantes, al tiempo que se preserva la capacidad del conjugado resultante para actuar como composición inmunogénica con las propiedades deseadas de "efecto transportador". El documento WO-A-93/15760 se refiere a un constructo inmunogénico transportador doble que consiste en al menos un transportador primario que comprende una molécula de gran peso molecular superior a un peso molecular de 70 kD y al menos un transportador secundario que comprende un antígeno dependiente de T conjugado con una transportador primario. En el documento EP 0941738 se describe un método para conjugar un polisacárido con una proteína transportadora.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para conjugar un inmunógeno peptídico mediante un grupo reactivo de un resto aminoacídico del inmunógeno peptídico con un transportador proteico/polipeptídico que tiene uno o más grupos funcionales, comprendiendo el método las etapas de:

(a) derivatizar uno o más de los grupos funcionales del transportador proteico/polipeptídico para generar un transportador derivatizado con sitios reactivos, en el que el transportador está seleccionado del grupo que consiste en CRM197, ORF1224 de Streptococcus pyogenes, ORF1664 de Streptococcus pyogenes, ORF2452 de Streptococcus pyogenes y ORF T858 de Chlamydia pneumoniae;

(b) hacer reaccionar el transportador proteico/polipeptídico derivatizado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un aminoácido del inmunógeno peptídico en condiciones de reacción tales que el inmunógeno peptídico se conjugue con el transportador proteico/polipeptídico derivatizado mediante los grupos funcionales; y

(c) hacer reaccionar adicionalmente el conjugado con N-acetilcisteamina para inactivar los grupos funcionales libres reactivos sin reaccionar en el transportador proteico/polipeptídico derivatizado, preservando así la funcionalidad del transportador, de manera que conserve su capacidad para inducir las respuestas inmunitarias deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera no se producirían sin un transportador, en el que el conjugado tiene la fórmula:

en la que C es el... [Seguir leyendo]

1. Método para conjugar un inmunógeno peptídico mediante un grupo reactivo de un resto aminoacídico del inmunógeno peptídico con un transportador proteico/polipeptídico que tiene uno o más grupos funcionales, comprendiendo el método las etapas de:

(a) derivatizar uno o más de los grupos funcionales del transportador proteico/polipeptídico para generar un transportador derivatizado con sitios reactivos, en el que el transportador está seleccionado del grupo que consiste en CRM197, ORF1224 de Streptococcus pyogenes, ORF1664 de Streptococcus pyogenes, ORF2452 de Streptococcus pyogenes y ORF T858 de Chlamydia pneumoniae;

(b) hacer reaccionar el transportador proteico/polipeptídico derivatizado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un aminoácido del inmunógeno peptídico en condiciones de reacción tales que el inmunógeno peptídico se conjugue con el transportador proteico/polipeptídico derivatizado mediante los grupos funcionales; y

(c) hacer reaccionar adicionalmente el conjugado con N-acetilcisteamina para inactivar los grupos funcionales libres reactivos sin reaccionar en el transportador proteico/polipeptídico derivatizado, preservando así la funcionalidad del transportador, de manera que conserve su capacidad para inducir las respuestas inmunitarias deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera no se producirían sin un transportador, en el que el conjugado tiene la fórmula:

en la que C es el transportador proteico/polipeptídico, Xd es un grupo funcional derivatizado del transportador proteico/polipeptídico, P es el inmunógeno peptídico, R es una molécula de protección, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85.

2. Conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico que tiene la fórmula:

en la que,

C es el transportador proteico/polipeptídico seleccionado del grupo que consiste en CRM197, ORF 1224 de Streptococcus pyogenes, ORF1664 de Streptococcus pyogenes, ORF2452 de Streptococcus pyogenes y ORF T858 de Chlamydia pneumoniae, Xd es un grupo funcional derivatizado de un resto aminoacídico del transportador proteico/polipeptídico, P es una molécula de inmunógeno peptídico fijada covalentemente al grupo funcional derivatizado del resto aminoacídico del transportador proteico/polipeptídico, R es una molécula de protección formada por la reacción del conjugado con N-acetilcisteamina fijada covalentemente al grupo funcional derivatizado de un resto aminoacídico del transportador proteico/polipeptídico, preservando así la funcionalidad del transportador de manera que conserve su capacidad para inducir las respuestas inmunitarias deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera no se producirían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85.

3. Método según la reivindicación 1, o conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 2, en el que el transportador proteico/polipeptídico es CRM197.

4. Método según la reivindicación 1, o conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 2, en el que el inmunógeno peptídico está seleccionado del grupo que consiste en una proteína bacteriana, una proteína viral, una proteína fúngica, una proteína parasitaria y una proteína eucariota.

5. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente introducir un resto cisteína en el extremo C-terminal o N-terminal del inmunógeno peptídico.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el resto cisteína se introduce en el extremo C-terminal del inmunógeno peptídico.

7. Método según la reivindicación 5, en el que el resto cisteína se introduce en el extremo N-terminal del inmunógeno peptídico.

8. Conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 2, en el que el inmunógeno peptídico comprende un resto cisteína situado en el extremo amino terminal del inmunógeno peptídico o en el extremo carboxilo terminal del inmunógeno peptídico.

9. Conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 8, en el que el resto cisteína está situado en el extremo carboxilo terminal del inmunógeno peptídico.

10. Conjugado inmunogéno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 8, en el que el resto cisteína está situado en el extremo amino terminal del inmunógeno peptídico.

11. Método según la reivindicación 1, o conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 2, en el que el grupo funcional de una o más moléculas de aminoácido del transportador proteico/polipeptídico se derivatizan utilizando un reactivo de entrecruzamiento.

12. Método o conjugado inmunógeno peptídico-transportador proteico/polipeptídico según la reivindicación 11, en el que el transportador proteico/polipeptídico se hace reaccionar con un agente de haloacetilación.

13. Composición inmunogénica que comprende un conjugado de un inmunógeno peptídico con un transportador proteico/polipeptídico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, u 8 a 12, junto con uno o más excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

14. Composición inmunogénica según la reivindicación 13, en la que uno o más adyuvantes están seleccionados del grupo que consiste en GM-CSF, 529 SE, IL-12, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, lipopolisacáridos bacterianos, compuestos de fosfato de aminoalquil-glucosamina, MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacilado) , un polipéptido, Quil A, STIMULON™ QS-21, una toxina de pertussis (PT) , una toxina termolábil de E. coli (LT) , IL-1 α, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón α, interferón β, interferónγ, G-CSF, TNF-α y TNF-β.