Compuestos de glicano N-enlazado.

Un compuesto aislado o purificado que comprende A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc QuiNAc4NAc, en el que A es Glc-NAc o Glc.

Compuestos de glicano N-enlazado Campo de la invención La invención se refiere a un compuesto de glicano N-enlazado de fórmula 1, que opcionalmente puede estar condensado o unido a un aminoácido, un péptido, una proteína o un lípido. La invención se refiere también a anticuerpos y a antisueros contra dicho compuesto, y a su uso para diagnosticar una infección provocada por un patógeno de Campylobacter. La invención se refiere también al uso del compuesto como una vacuna para tratar o prevenir una infección por un patógeno de Campylobacter.

Antecedentes Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son las dos especies de Campylobacter que se aislan con más frecuencia que provocan una infección en seres humanos. Estos organismos provocan una altas tasas de gastroenteritis en todo el mundo y, a menudo, el número de casos es mayor que para Salmonella, Shigella y E. coli enterotoxigénica combinadas (Butzler J.P., Clinical Microbiology and Infection, 2004) . Además, la infección por C. jejuni se ha relacionado con el desarrollo del síndorme de Guillain-Barré, la causa más común de parálisis provacada por patógenos desde la erradicación de la polio (véanse los artículos: Kaida K., Glycobiology, 2009; Bereswill S. y Kist M., Current Opinion in Infectious Diseases, 2003) . Otras especies de Campylobacter han sido reconocidas como patógenos emergentes en la gastroenteritis humana (C. upsaliensis, C. hyointestinalis) , han sido asociadas con la enfermerdad del intestino inflamatoria en niños, con la gingivitis, la periodontitis y abortos en mujeres (C. retus, C. concisus) (Zhang L.S. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2009) y en la causa de enfermedad venérea e infertilidad en ganado (en especial ganado vacuno; C. fetus venerealis) , y abortos en ovejas (C. fetus fetus) (Butzler J.P., Clinical Microbiology and Infection, 2004, y las referencias citas allí) .

Desde la publicación de la primera secuencia del genoma de C. jejuni en 2000 (Parkhill J. et al., Nature, 2000) , se han indicado varias otras secuencias genómicas de Campylobacter. A diferencia de la mayoría de las bacterias que se han descrito hasta la fecha, todas las Campylobacter contienen los genes pgl conservados necesarios para la glicosilación de proteínas N-enlazadas (Szymanski C.M. y Wren B.W., Nature Reviews Microbiology, 2005; Nothaft

H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010) .

En eucariotas, las proteínas glicosiladas son componentes ubicuos de las matrices extracelulares y las superficies celulares. Sus restos oligosacáridos están implicados en una amplia gama de acontecimientos de reconocimiento entre células y entre células y matriz que son vitales en procesos biológicos que varían desde el reconocimiento inmunológico hasta el desarrrollo de cáncer. La glicosilación se ha considerado limitada a eucariotas, aunque debido a los avances en los métodos analíticos y la secuenciación genómica, cada vez existen más informes de vías de glicosilación de proteínas O-enlazadas y N-enlazadas en bacterias (Nothaft H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010) . Desde el descubrimiento de la primera vía de glicosliación de proteínas general en bacterias (Szymanski C.M. et al., Molecular Microbiology, 1999) , la demostración de que los glicanos de C. jejuni se unen a través de un N-enlace al unísono (Kelly J.H. et al., Journal of Bacteriology, 2006; Wacker M. et al., Science, 2002; Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2002) y de que la vía no solo puede transferirse funcionalmente a Escherichia coli (Wacker M. et al., Science, 2002) , sino que la enzima oligosacariltransferasa (PgIB) es capaz de añadir azúcares extraños a proteínas (Feldman M. et al., PNAS, 2005) , se ha producido una oleada de actividad de investigación que ha dado como resultado una mayor caracterización y aprovechamiento de este sistema.

Se ha descrito la estructura detallada del heptasacárido exclusivo de C. jejuni N-enlazado (Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2002) . Empleando métodos, tales como la RMN de giro alrededor del ángulo mágico de alta resolución (HR-MAS) (Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2003) , se ha demostrado que este heptasácarido está conservado, en estructura, en C. jejuni y C. coli.

Se ha descrito un intermedio en la vía de glicosilación N-enlazada de C. jejuni, concretamente un (oligo) heptasacárido libre (fOS) , un componente soluble del espacio periplásmico de C. jejuni (Liu X. et al., Analytical Chemistr y , 2006) . Este fOS tiene una estructura idéntica a la de los oligosacáridos N-enlazados añadidos a proteínas (Nothaft H. et al., PNAS, 2009) . Bajo condiciones de crecimiento en laboratorio, la proporción de fOS frente a heptasacárido N-enlazado a proteínas es de aproximadamente 9:1. El fOS en C. jejuni desempeña un papel en la osmorregulación similar a los glucanos periplásmicos bacterianos, y esta vía puede manipularse alterando la concentración de osmolitos del entorno (Nothaft H. et al., PNAS, 2009) .

La figura 1 muestra la glicosilación de proteínas N-enlazadas y oligosacáridos libres en C. jejuni. El heptasacárido undecaprenil-pirofosfato-enlazado se ensambla en el citosol mediante la adición de azúcares activados por nucleótidos (Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2003; Szymanski C.M. et al., Trends Microbiology, 2003) . El heptasacárido completo es translocado a través de la membrana interna hacia el periplasma por el transportador ABC PgIK (Alaimo C. et al., EMBO Journal, 2006) . El oligosacárido es transferido al grupo amino de la asparagina en la secuencia de proteína consenso D/E-X1-N-X2-S/T, en la que X1, X2 pueden ser cualquier aminoácido excepto prolina, por PgIB (Kowarik M. et al., EMBO Journal, 2006; Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2002) . Además, pueden encontrarse grandes cantidades de heptasacárido libre (fOS) en C.

jejuni (Liu X. et al., Analytical Chemistr y , 2006) ; se ha determinado que la proporción de fOS a N-glicanos es de 9:1. GlcNAc, N-acetilgalactosamina; bacilosamina (Bac) , 2, 4-diacetamido-2, 4, 6-tridesoxiglucosa; GalNAc, Nacetilgalactosamina; Glc, glucosa (adaptado de Szymanski C.M. et al., Trends Microbiology, 2003) .

Compendio Los inventores han determinado las estructuras de N-glicanos y fOS de una serie de especies de Campylobacter, todas las cuales poseen glicanos N-enlazados y fOS. Además, los inventores han demostrado que los N-glicanos y fOS de Campylobacter pueden dividirse en dos grupos estructurales. El primer grupo produce una estructura similar a la publicada para C. jejuni y C. coli (Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2002; Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistr y , 2003) . El segundo grupo produce una estructura de glicano exclusiva que se diferencia de la determinada para C. jejuni y C. coli y que nunca ha sido descrita. Las especies de Campylobacter incluidas en este grupo incluyen Campylobacter fetus venerealis (provoca enfermedad venérea en ganado vacuno) , Campylobacter fetus fetus (provoca abortos en ovejas) , Campylobacter concisus (asociado con la gingivitis y la periodontitis, y ha sido aislado a partir de heces de pacientes con gastroenteritis) , Campylobacter hyointestinalis (al igual que C. jejuni y C. coli, está asociado con enfermedades diarreicas) y subespecies de Campylobacter hyointestinalis.

Se cree que Campylobacter sputorum y subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus (un patógeno entérico emergente que se ha sugerido que está implicado en la gastroenteritis, Bullman S. et al., FEMS Immunology & Medical Microbiology, 2010) , Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus (enfermedad periodontal y aborto en mujeres) , Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus pertenecen al segundo grupo.

La figura 2 ilustra un análisis filogenético de las secuencias de proteína del componente clave de esta vía, la oligosacariltransferasa (PgIB) , que incluye especies de Campylobacter con genoma secuenciado y otros organismos relacioandos, y demuestra que Campylobacter se divide en dos grupos. Dentro de Campylobacter, la rama de las especies que producen la estructura 1 está en el recuadro superior, y las cepas que producen la fórmula 1A y la fórmula 1B están en el recuadro inferior (adaptado de Nothaft H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010) .

La figura 3 ilustra la reactividad del N-glicano contra (A) un antisuero específico del N-glicano de C. jejuni, (B) SBAlectina (que reconoce los restos GalNAc terminales de la estructura 1) , (C) reactividad de WGA-lectina (que reconoce los restos GlcNAc terminales de fórmula 1A... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto aislado o purificado que comprende A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc QuiNAc4NAc, en el que A es Glc-NAc o Glc.

2. El compuesto de la reivindicación 1 conectado o enlazado a un único aminoácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína o un lípido.

3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que dicho único aminoácido es asparagina.

4. Una vacuna que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La vacuna de la reivindicación 4, que comprende además un adyuvante.

6. La vacuna de las reivindicaciones 4 o 5 para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por un organismo de Campylobacter, en la que el compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 comprende un glicano nativo dentro de dicho organismo.

7. La vacuna de la reivindicación 6, en la que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.

8. La vacuna de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por un organismo de Campylobacter, en la que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo.

9. La vacuna de la reivindicación 8, en la que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinaltis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.

10. La vacuna de las reivindicaciones 4 o 5 para su uso para mejorar la productividad y la salud de un rebaño de animales o la salud de un ser humano.

11. Un anticuerpo o un antisuero eficaz contra un organismo de Campylobacter, en el que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo, y dicho anticuerpo o antisuero comprende un anticuerpo o un antisuero específico para el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. El anticuerpo o el antisuero de la reivindicación 11, en el que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinaltis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.

13. Un método para diagnosticar la presencia de una infección en un animal o un ser humano provocada por un organismo de Campylobacter, en el que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo, poniendo en contacto una muestra procedente del animal o del ser humano con el anticuerpo o el antisuero de la reivindicación 11 o 12.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, o Campylobacter ureolyticus.