Antígenos de la gripe recombinantes solubles.

Una hemaglutinina recombinante (rHA), que comprende:

a) un dominio de hemaglutinina seleccionado del grupo que consiste de los subtipos de hemaglutinina H1,

H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, y H16; y

b) un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en un péptido GCN4-pII y un dominio rico en prolina (PRD) de g-zeína de maíz, en donde los residuos de aminoácidos se adicionan al extremo del terminal C del dominio de oligomerización de tal manera que el dominio de oligomerización no termina en una hélice α;

c) péptido señal

d) una señal de retención en el retículo endoplásmico (ER), y

en donde la rHA se produce como un homotrímero soluble quimérico.

Antígenos de la gripe recombinantes solubles Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de antígenos de la gripe recombinantes solubles. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de antígenos de la gripe recombinantes solubles que retienen la inmunogenicidad.

Antecedentes de la invención

La gripe es la causa principal de muerte en los seres humanos debida a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, dificultad para respirar y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, los virus de la gripe infectan a un 10-20% de la población en todo el mundo, dando lugar a 250-500,000 muertes al año.

Los virus de la gripe se clasifican en tipos A, B, o C, en base a las nucleoproteínas y antígenos de proteína de la matriz presentes. Los virus de la gripe tipo A, además se pueden dividir en subtipos de acuerdo con la combinación de glicoproteínas de la superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentadas. La HA regula la capacidad del virus para unirse y penetrar en la célula huésped. NA elimina los residuos de ácido siálico terminales de las cadenas de glicano en la célula huésped y las proteínas de la superficie viral, lo que evita la agregación viral y facilita la movilidad virus. En la actualidad, se reconocen 16 subtipos de HA (H1-H16) y 9 subtipos de NA (N1-N9). Cada virus de la gripe tipo A presenta un tipo de la glicoproteína de HA y un tipo de NA. Generalmente, cada subtipo exhibe especificidad de especie; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos HA y NA infectan a las aves, mientras que se ha demostrado que sólo los subtipos H1, H2, H3, H5, N1 y N2 infectan a los humanos. Los virus de gripe que comprenden H5 y H7 se consideran las formas más altamente patógenas del virus de la gripe A, y son más susceptibles de causar futuras pandemias.

Las pandemias de gripe son causadas generalmente por los virus de gripe altamente virulentos y transmisibles, y pueden conducir a niveles elevados de enfermedad y muerte en el mundo. La aparición de nuevos subtipos de gripe A produjo 4 grandes pandemias en el siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918-1919 condujo a la muerte de más de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 1920. El riesgo de la aparición de un nuevo subtipo, o de la transmisión a los seres humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. De particular preocupación es una forma muy virulenta de la gripe aviar (también llamada "gripe aviar"), brotes de esta se han reportado en varios países de todo el mundo. En muchos casos, la gripe aviar puede resultar en tasas de mortalidad cercanas al 100% en 48 horas. Se ha postulado que la propagación del virus de la gripe aviar (H5N1), identificado por primera vez en Hong Kong en 1997, a otros países de Asia y Europa está vinculada a los patrones migratorios de las aves silvestres.

Existe una creciente preocupación de que el virus puede llegar a ser altamente infeccioso para los seres humanos. El principal problema para la salud humana es el hecho de que los virus de gripe son antigénicamente inestables, es decir, que mutan rápidamente. Si el virus de la gripe aviar entrara en contacto con los virus humanos, la recombinación genética del virus aviar podría resultar en un virus de la gripe altamente patógeno que podría causar una enfermedad grave o muerte en los seres humanos. Además, dicha mutación podría resultar en un virus de la gripe que se transmite fácilmente en los seres humanos.

El método actual de la lucha contra la gripe en los seres humanos es mediante la vacunación anual. Cada año, la Organización Mundial de la Salud selecciona 3 cepas virales para la inclusión en la vacuna anual de la gripe, que se produce en huevos fertilizados. Sin embargo, el número de dosis de vacuna producido cada año no es suficiente para vacunar a la población del mundo. Por ejemplo, Canadá y los Estados-Unidos obtienen suficientes dosis de vacuna para inmunizar a cerca de un tercio de su población, mientras que sólo el 17% de la población de la Unión Europea puede ser vacunado. Es evidente que la actual producción mundial de vacunas contra la gripe sería insuficiente frente a una pandemia de gripe en todo el mundo. Por lo tanto, los gobiernos y la industria privada por igual han dirigido su atención a las producciones de vacunas eficaces contra la gripe.

Como se mencionó anteriormente, el método actual de obtención de vacunas contra el virus de la gripe es por medio de la producción en huevos fertilizados. El virus se cultiva en huevos fertilizados, seguido por la inactivación del virus y la purificación de glicoproteínas virales. Si bien este método mantiene el epítopo antigénico y las modificaciones post-traducción, existe una serie de inconvenientes, incluyendo el riesgo de contaminación debido a la utilización de todo virus y rendimientos variables dependiendo de la cepa del virus. Niveles subóptimos de protección pueden resultar de la heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en los huevos. Otras desventajas incluyen una amplia planificación para la obtención de huevos, los riesgos de contaminación debido a los productos químicos utilizados en la purificación, y los largos tiempos de producción. Además, las personas hipersensibles a las proteínas del huevo, no pueden ser candidatos elegibles para recibir la vacuna.

Para evitar el uso de huevos, también se ha producido el virus de la gripe en cultivo de células de mamífero, por ejemplo, en células MDCK o PERC.6, o similares. Otro enfoque es la genética inversa, en la cual los virus se producen mediante la transformación de células con genes virales. Estos métodos, sin embargo, también requieren el uso de todo el virus, así como los métodos elaborados y ambientes de cultivo específicos.

Se ha explorado, el uso del ADN viral como una vacuna. En esta tecnología, la protección se obtiene mediante la expresión de antígenos virales en células humanas; a continuación, los antígenos se reconocen como antígeno extraño, lo que conduce a una respuesta de anticuerpos específica. Sin embargo, existe el riesgo de activación de oncogenes de introducción de ADN dentro de la porción determinante del genoma de la célula humana - un inconveniente significativo.

También se han preparado, vacunas que comprenden antígenos virales recombinantes expresados en céluias de insectos o de plantas transformadas del ADN viral por Dow Agroscience (véase, por ejemplo WO 2004/098530). Aunque el riesgo asociado con el uso de virus vivo se evita y el proceso de producción es más corto, se ven afectadas la conformación de proteínas y las modificaciones post-traducción. Las etapas de purificación y apiicación a gran escala también son relativamente complejas, ya que los antígenos están asociados con tas membranas celulares. Además, la dosis de baculovirus-HA recombinante, necesaria para ia inmunización eficaz en animaies es 10 veces mayor que la de HA natural producida en huevos fertiiizados. En ambos casos, ios niveies de expresión de! antígeno viral son bajos.

En un esfuerzo por evitar las dificultades asociadas con ia purificación de proteínas de membrana, Huang et a! (2001, Vaccine, 19:2163-2171) sustituyó ai dominio transmembrana y ia coia citopiásmica de ia HA de! sarampión con una señal de retención en el ER. La proteína HA resuitante se produjo en céiuias de piantas de tabaco para ei desarrollo de la vacuna oral (vacuna comestibie). La HA expresada no es retenida tan fuertemente en ei ER como io es con el dominio transmembrana, simpiificando así e! procedimiento de purificación. Sin embargo, ia forma trimérica natural de HA no se puede formar en esas condiciones, io que puede afectar ia inmunogenicidad de ia proteína recombinante.

Saelens et al (1999, Eur. J. Biochm, 260:166-175) expresaron un gen de HA que carece de! dominio transmembrana en levaduras (P/c/?/a pasfor/'s), lo que üeva a ia secreción de HA monomérica. Esta forma, sin embargo, fue menos inmunogénica que la HA trimérica. La pubiicación de Wei et a! "Comparative Efficacy of Neutraiizing Antibodies Elicited by Recombinant Hemaggiutinin Proteins from Avian H5N1 infiuenza Virus", Jouma! of Viroiogy, Juiy 2008, p. 6200-6208 analiza las diversas formas de ia proteína rHA por su potencia) eficacia como vacuna. WO 02/074795 se refiere a una proteína quimérica que comprende un antígeno y un dominio de oiigomerización. WO 2008/054540 proporciona los polinucleótidos y poiipéptidos capaces de potenciar ia respuesta inmune de un ser humano en necesidad de protección contra la infección por virus de ia gripe. WO 2009/076778 se refiere a un método para sintetizar partículas... [Seguir leyendo]

1. Una hemaglutinina recombinante (rHA), que comprende:

a) un dominio de hemaglutinina seleccionado del grupo que consiste de los subtipos de hemaglutinina H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, y H16; y

b) un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en un péptido GCN4-pll y un dominio rico en prolina (PRD) de y-zeína de maíz, en donde los residuos de aminoácidos se adicionan al extremo del terminal C del dominio de oligomerización de tal manera que el dominio de oligomerización no termina en una hélice a;

c) péptido señal

d) una señal de retención en el retículo endoplásmico (ER), y

en donde la rHA se produce como un homotrímero soluble quimérico.

2. La rHA de la reivindicación 1, en donde los residuos de aminoácidos adicionados son Ser-Ala-Ala.

3. La rHA de la reivindicación 1 o 2, en donde la señal de retención en el ER es SEKDEL o HDEL.

4. La rHA de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el PRD tiene 4, 6 u 8 repeticiones de péptidos.

5. La rHA de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI).

6. Una secuencia de nucleótidos que codifica la rHA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que expresa la rHA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una célula huésped transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 6.

10. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 7.

11. Un método para producir rHA, que comprende proporcionar una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6, y la expresión de la rHA en la célula huésped.

12. Un método de expresión de rHA dentro de una planta que comprende introducir un vector de la reivindicación 7 en la planta y la expresión de la rHA.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el ácido nucleico se introduce en la planta de una manera transitoña o el ácido nucleico se introduce en la planta de modo que sea estable.

14. Un método para producir una hemaglutinina recombinante (rHA) en una planta que comprende:

a) introducir una secuencia de ácido nucleico en la planta, o parte del mismo, la secuencia de ácido nucleico que comprende una región reguladora unida operativamente al ácido nucleico de la reivindicación 6 y

b) cultivar la planta transgénica, produciendo de este modo la rHA.

15. El método de la reivindicación 14, en donde en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico se introduce en la planta de una manera transitoña o el ácido nucleico se introduce en la planta de modo que sea estable.