Análisis del patrón de glicosilación de inmunoglobulina.

Método para determinar el patrón de glicosilación de una inmunoglobulina humana o humanizada de la subclase IgG1,

IgG2 o IgG4, o de un fragmento Fab2 de las mismas, que comprende las siguientes etapas:

a) división de dicha inmunoglobulina en fragmentos por digestión enzimática con el enzima IdeS y tratamiento de dicha inmunoglobulina con carboxipeptidasa B,

b) tratamiento con ácido fórmico y TCEP de dicha inmunoglobulina dividida enzimáticamente,

c) separación mediante cromatografía líquida de fase inversa de alto rendimiento de los fragmentos de dicha inmunoglobulina obtenidos por digestión enzimática,

d) análisis por espectrometría de masas, realizada en ausencia de ácido trifluoroacético, de los fragmentos de dicha inmunoglobulina separados en la etapa c), y

e) determinación del patrón de glicosilación de dicha inmunoglobulina a partir de los datos de la espectrometría de masas obtenidos en la etapa d).

Análisis del patrón de glicosilación de inmunoglobulina

La presente invención se refiere a un método para determinar el patrón de glicosilación de un fragmento Fe de inmunoglobulina. También se presenta un método para determinar el patrón de glicosilación de una inmunoglobulina glicosilada, así como un método para producir un fragmento Fab2 de inmunoglobulina.

Antecedentes de la presente invención

En los últimos años la industria farmacéutica ha tenido mucho éxito con productos basados, entre otros, en enzimas, anticuerpos y citosinas, tales como eritropoyetina, ¡nterferones, activador de plasminógeno, etc. y la demanda mundial de agentes terapéuticos proteicos aumenta cada año. Los anticuerpos monoclonales (AMC) son un grupo importante de agentes terapéuticos proteicos. Se llaman monoclonales porque, a diferencia de los anticuerpos policlonales, son secretados por células inmunitarias (clones celulares) derivadas de una sola célula formadora de anticuerpos. Una característica de los anticuerpos monoclonales es que cada uno de ellos va dirigido solamente contra un epítopo de una sustancia inmunógena y por tanto se puede usar muy específicamente en el tratamiento de enfermedades. Como ejemplos de agentes terapéuticos proteicos cabe mencionar los anticuerpos monoclonales trastuzumab (marca comercial: Herceptin), daclizumab (marca comercial: Zenapax) y rituximab (marca comercial: MabThera), producidos por Roche, que entre otras cosas se han utilizado con éxito para el tratamiento del cáncer de mama (trastuzumab), el rechazo de órganos (daclizumab) y el linfoma no Hodgkin.

Los anticuerpos monoclonales terapéuticos se obtienen mediante procesos biotecnológicos complejos. Durante su producción, formulación y almacenamiento se pueden formar productos de degradación, debido frecuentemente a procesos tales como oxidación y desamidación, y también a divisiones proteolíticas (Yan, B. y otros, J. Chromatogr. A 1164 (27) 153-161). Además de su acción también es importante la calidad de un producto biofarmacéutico, es decir su pureza, integridad, estado de agregación y patrón de glicosilación.

La cisteína endoproteasa IdeS (enzima que degrada la inmunoglobulina) del patógeno humano Streptococcus pyogenes, también conocida como Mac-1 o sib-38, es una cisteína proteasa que divide específicamente la cadena pesada de los anticuerpos del tipo de la inmunoglobulina G (IgG). La IgG es hasta ahora el único sustrato conocido del enzima IdeS (Vlncents, B. y otros, Biochem. 43 (24) 1554-15549). El IdeS consta de 339 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 29 aminoácidos (von Pawel-Rammingen, U. y otros, EMBO J. 21 (22) 167-1615). El IdeS corta las subclases lgG1, lgG3 e lgG4 de IgG humana entre los aminoácidos 236 y 237 (Gly-Gly) contenidos en la secuencia de reconocimiento (LL)GGP. La lgG2 humana se escinde entre los aminoácidos alanina y glicina en el motivo de reconocimiento PVAGP. Los anticuerpos murinos de los tipos lgG2a e lgG3, así como la IgG de conejo (LLGGPS), también se dividen (véase Vincents, B. y otros, Biochem. 43 (24) 1554-15549; Wenig, K., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 11 (24) 17371-17376).

Hess, J.K., y otros (Hess, J.K., y otros, J. Microbiol. Meth. 7 (27) 284-291) revelan un método de espectrometría de masas para determinar la actividad enzimática de IdeS con la ayuda de la espectrometría de masas SELDI-TOF. En la patente US 27/237784 se describe un pollpéptldo aislado del S. pyogenes que tiene actividad de cisteína proteasa IgG. En la patente europea EP 1 458 861 A se describe un método para la formación de fragmentos de anticuerpo Fe o Fab. En la patente WO 26/131347 se describe la proteasa IdeS de los estreptococos del grupo A.

El perfil de glicosilación - p.ej. de un polipéptido - es una característica importante para muchos polipéptidos terapéuticos producidos de forma recombinante. Los polipéptidos glicosilados, también denominados glicoproteínas, intervienen en muchas funciones esenciales de organismos eucariotas, p.ej. humanos, y de algunos procariotas, incluyendo catálisis, señalización, comunicación célula-célula, actividades del sistema inmunitario, así como reconocimiento y asociación molecular. Constituyen la mayoría de proteínas no citosólicas en los organismos eucariotas (Lis, H. y otros, Eur. J. Biochem. 218 (1993) 1-27). La formación/fijación de oligosacáridos a una proteína es una modificación co- y post-translacional, y por lo tanto no está controlada genéticamente. La biosíntesis de oligosacáridos es un proceso de varias etapas en el cual están involucrados varios enzimas que compiten entre sí por el substrato. Por consiguiente los polipéptidos glicosilados comprenden una variedad microheterogénea de oligosacáridos que dan lugar a un conjunto de glicoformas distintas que contienen la misma estructura principal de aminoácidos.

Los oligosacáridos unidos mediante enlace covalente influyen en la estabilidad física, el plegamiento, la resistencia al ataque de las proteasas, las interacciones con el sistema inmunitario, la bioactividad y la farmacocinética del respectivo polipéptido. Además algunas glicoformas pueden ser antígenas, lo cual da pie a que los organismos de regulación exijan análisis de las estructuras de los oligosacáridos de los polipéptidos glicosilados recombinantes (véase p.ej. Paulson, J.C., Trends Biochem. Sci. 14 (1989) 272-276; Jenkins, N. y otros, Nature Biotechnol. 14 (1998) 975-981). Se ha señalado, por ejemplo, que la sialilación terminal de los polipéptidos glicosilados incrementa la vida media del suero y que los polipéptidos glicosilados provistos de estructuras de oligosacárido con restos de galactosa terminales son eliminados en mayor medida de la circulación (Smith, P.L. y otros, J. Biol. Chem. 268 (1993) 795-82).

Las ¡nmunoglobulinas se diferencian de otros polipéptidos recombinantes por su patrón de glicosilación. Por ejemplo la ¡nmunoglobullna G (IgG) es un polipéptido glicosilado multlfunclonal y simétrico que tiene una masa molecular aproximada de 15 kDa y consta de dos fragmentos Fab idénticos, responsables de la fijación de antígenos, y del fragmento Fe para las funciones efectoras. En las moléculas de IgG la glicosilación tiende a estar muy conservada en el sitio Asn-297, que está oculto entre los dominios CH2 de la cadena pesada de Fe formando extensos contactos con los restos de aminoácidos en el interior de CH2 (Sutton y Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 13-132). Las estructuras de oligosacárido unidas al Asn-297 se procesan heterogéneamente y por lo tanto una IgG existe en múltiples glicoformas. Hay variaciones en la ocupación del sitio del resto Asn-297 (macroheterogeneidad) o en la estructura del oligosacárido en el sitio de glicosilación (microheterogeneidad), véase por ejemplo Jenkins, N. y otros, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

Para analizar los segmentos de carbohidrato de los polipéptidos glicosilados se ha empleado la cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrlca pulsada (HPAEC) y la espectrometría de masas por desorclón/lonlzaclón láser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) (véase p.ej. Fukuda, M., (ed.) Glycoblology: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Morelle, W. y Michalsky, J.C., Curr. Pharmaceut. Deslgn 11 (25) 2615-2645). Hoffstetter-Kuhn y otros (Electrophoresls 17 (1996) 418-422) utilizaron el análisis por electroforesls capilar y MALDI-TOF MS para describir la heterogeneidad de un anticuerpo monoclonal debida a los ollgosacárldos, tras la desgllcosilación del anticuerpo con N-gilcosIdasa F (PNGasa F).

Dada la Importancia de la glicosilación en las propiedades funcionales de los polipéptidos glicosilados recombinantes y la necesidad de un proceso de elaboración de los productos bien definido y consistente, es muy conveniente disponer en línea o junto a ella de un análisis del patrón de glicosilación de los polipéptidos glicosilados producidos de forma recombinante durante el proceso de fermentación. Papac y otros (Glycoblol. 8 (1998) 445-454) revelaron un método que incluye la Inmovilización de polipéptidos glicosilados sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno, la digestión enzlmátlca y el análisis por MALDI-TOF MS del perfil de glicosilación. El análisis y la caracterización molecular de los AMC producidos de forma recombinante, Incluyendo varias etapas cromatográficas, está descrito en Balley, M. y otros, J. Chromat. 826 (25) 177-187.

Las ¡nmunoglobulinas producidas por células de mamíferos contienen 2-3% en masa de carbohidratos (Taniguchi, T. y otros, Biochem. 24 (1985) 5551-5557). En una inmunoglobulina de clase G (IgG) esto equivale p.ej. a 2,3 restos de azúcar en una IgG de origen... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar el patrón de glicosilación de una ¡nmunoglobulina humana o humanizada de la subclase lgG1, lgG2 o lgG4, o de un fragmento Fab2 de las mismas, que comprende las siguientes etapas:

a) división de dicha ¡nmunoglobulina en fragmentos por digestión enzimática con el enzima IdeS y tratamiento de dicha ¡nmunoglobulina con carboxipeptidasa B,

b) tratamiento con ácido fórmico y TCEP de dicha ¡nmunoglobulina dividida enzimáticamente,

c) separación mediante cromatografía líquida de fase inversa de alto rendimiento de los fragmentos de dicha ¡nmunoglobulina obtenidos por digestión enzimática,

d) análisis por espectrometría de masas, realizada en ausencia de ácido trifluoroacético, de los fragmentos de dicha ¡nmunoglobulina separados en la etapa c), y

e) determinación del patrón de glicosilación de dicha ¡nmunoglobulina a partir de los datos de la espectrometría de masas obtenidos en la etapa d).

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha etapa de separación consiste en:

- desalar mediante una cromatografía de exclusión de tamaños los fragmentos obtenidos de dicha ¡nmunoglobulina.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha división se lleva a cabo en un intervalo de pH comprendido entre 5,5 y 8,5.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la división se lleva a cabo durante dos horas.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la relación molar de IdeS a molécula de ¡nmunoglobulina está comprendida entre 1:25 y 1:25.