Dispositivo y procedimiento para aislar y cultivar células vivas en filtro o extraer su material genético.

Dispositivo para asilar células fijadas o vivas en un filtro (108,

308), o extraer el material genético de las citadas células, que comprende:

- un compartimiento (102, 302) que presenta un volumen interior para recibir un líquido que comprende las citadas células, una abertura inferior y una entrada de aire,

- un medio (110) móvil con respecto al compartimiento, presentando este medio móvil patas,

- un filtro solidario, al menos temporalmente, de la citada abertura del compartimiento o del ciado medio móvil, adaptado para retener las citadas células durante el paso del líquido a través del filtro,

- una aguja (180) solidaria, al menos temporalmente de la citada abertura del compartimiento, de manera estanca, encontrándose el filtro entre la aguja y el volumen interior del compartimiento, estando la citada aguja adaptada para perforar un tapón (186) de tubo de vacío (185) que presenta una depresión con respecto a la presión ambiente para aspirar el líquido a través del citado filtro,

caracterizado por que comprende, además, un medio de unión (504, 520) entre el compartimiento y un cilindro de protección (502) que rodea a la aguja estando adaptado el citado medio de unión para rodear, al menos parcialmente, el tubo de vacío durante la aspiración del líquido a través del filtro,

en el cual el medio móvil y el compartimiento están configurados para ser puestos en movimiento relativo para aplicar una fuerza sobre el filtro y liberar el filtro después de la aspiración del líquido a través del filtro, y en el cual las patas del medio móvil están configuradas para, cuando el dedo de un operario ponga en movimiento relativo el medio móvil y el compartimiento, ejercer una presión sobre un soporte del filtro y liberar el soporte de filtro de la abertura del compartimiento.

Dispositivo y procedimiento para aislar y cultivar células vivas en filtro o extraer su material genético La presente invención concierne a un dispositivo y a un procedimiento para aislar y/o cultivar en un filtro células vivas o fijadas a fin de proceder a cualesquiera análisis celulares (citología, inmunocitoquimia, ensayos FISH, etc )

o extraer material genético eventualmente amplificado de células vivas o fijadas aisladas en un filtro. Ésta se aplica, en particular, a aislar y/o cultivar células particulares presentes en un líquido, especialmente la sangre, o a extraer el material genético de estas células particulares.

Ciertas células particulares de la sangre, por ejemplo las células tumorales o los trofoblastos, están en muy baja proporción y deben ser descontadas previamente a análisis citológicos.

Se conoce aplicar un tampón de fijación a base de formaldehído a una muestra sanguínea para fijar las células buscadas, y después hacer pasar el líquido resultante por un filtro poroso. Este filtro es utilizado a continuación para examinar en laboratorio al microscopio las células de éste buscadas. Sin embargo, este procedimiento no permite la obtención de células vivas.

Ahora bien, el inventor ha determinado que la obtención de células vivas permitiría constatar la identificación de marcadores específicos y aplicar en buenas condiciones técnicas de biología molecular, de citogenética y de " FISH " (acrónimo de " Fluorescence in Situ Hybridization ", hibridación fluorescente in situ) para el diagnostico de anomalías genéticas en células tumorales o trofoblásticas.

Por los documentos US 5 976 824, FR 2 127 835 y US 2007/105156, se conocen dispositivos y métodos para recoger una muestra de células a partir de una muestra líquida, empleando una aguja adaptada para perforar un tapón de tubo de vacío. Sin embargo, estos dispositivos y métodos presentan riesgos de un pinchazo accidental con la aguja. Además, estos no permiten ni una colocación fácil del tubo de vacío, ni su mantenimiento de manera rígida para evitar su retirada o su desplazamiento que permitiría al aire entrar en el tubo de vacío pasando en el lado de la aguja por el tapón del tubo de vacío.

El documento FR2926091 describe un dispositivo para aislar células fijadas o vivas en un filtro o extraer el materialgenético de célula. Éste comprende un compartimiento que presenta un volumen interior para recibir un líquido que comprende las células, una abertura inferior y una entrada de aire, un pistón móvil en el interior del compartimiento y un filtro solidario de la abertura del compartimiento para retener las células durante el paso del líquido a través del filtro.

Este dispositivo no presenta ni aguja ni medio de aspiración.

La presente invención pretende remediar estos inconvenientes y responder a esta necesidad permitiendo recoger, en condiciones compatibles con exámenes de laboratorio de rutina, células vivas que puedan ser cultivadas subsiguientemente en medios adaptados en presencia de factores de crecimiento adecuados.

La presente invención concierne también a la extracción del material genético eventualmente amplificado de células aisladas en filtro y la detección de mutaciones y de los niveles de la expresión de genes de sensibilidad y de resistencia a las terapias dirigidas o de anomalías genéticas.

Ésta se aplica, en particular, a recoger y eventualmente amplificar de modo uniforme el ADN o el ARN de células particulares presentes en un líquido, especialmente la sangre.

Se conoce, por ejemplo por el documento PCT/FR 2006/000562, aplicar un tampón de fijación a base de formaldehído a una muestra sanguínea para fijar las células buscadas, y después hacer pasar el líquido resultante por un filtro poroso. Este filtro es analizado después en laboratorio para buscar al microscopio las células de éste. A continuación, se las puede extraer del filtro para análisis, por ejemplo un análisis genético Sin embargo, este procedimiento no puede ser objeto de una reproducción a gran escala y a un coste razonable, debido al tiempo, a los materiales y a la precisión de trabajo que el mismo implica. Ahora bien, esta reproducción a gran escala y menor coste permitiría la conducción de análisis de biología molecular a la vez en células tumorales y en células trofoblásticas. Además, la fijación de las células por el formaldehído no permite obtener material genético de buena calidad: el ADN resulta en parte degradado y forma puentes con proteínas ambientes y la extracción de ARN está prácticamente excluida.

La presente invención pretende también poner remedio a estos inconvenientes y responder a esta necesidad permitiendo recoger en buen estado en condiciones compatibles con exámenes de laboratorio de rutina, una gran proporción de material celular, en particular ARN y ADN, de las células consideradas, . Hay que observar también que la presente invención permite el aislamiento de células fijadas con la ayuda de un fijador que contenga o no formaldehído.

A tal efecto, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención está destinada a un dispositivo para aislar en un filtro células fijadas, caracterizado por que comprende:

- un compartimiento que presenta un volumen interior para recibir un líquido que comprende las citadas células, una abertura inferior y una entrada de aire, -un medio móvil con respecto al compartimiento, comprendiendo este medio móvil brazos, -un filtro solidario, al menos temporalmente, de la citada abertura del compartimiento, adaptado para retener células durante el paso del líquido a través del filtro, -una aguja al menos temporalmente solidaria de la citada abertura del compartimiento, de manera estanca, encontrándose el filtro entre la aguja y el volumen interior del compartimiento, estando la citada aguja adaptada para perforar un tapón de tubo de vacío que presenta una depresión con respecto a la presión ambiente para aspirar el líquido a través del citado filtro y -un medio de unión entre el compartimiento y un cilindro de protección que rodea a la aguja y destinado a rodear, al menos parcialmente, el tubo de vacío durante la aspiración del líquido a través del filtro, en el cual el medio móvil y el compartimiento están configurados para ser puestos en movimiento relativo para aplicar una fuerza sobre el filtro y liberar el filtro después de la aspiración del líquido a través del filtro, y en el cual las patas del medio móvil están configuradas para, cuando el dedo de un operario ponga en movimiento relativo el medio móvil y el compartimiento, ejercer una presión sobre un soporte del filtro y liberar el soporte de filtro de la abertura del compartimiento.

Este dispositivo permite así el aislamiento y la recuperación en filtro de las células vivas de interés fijadas, o vivas, en condiciones perfectamente compatibles con su puesta en cultivo para continuar exámenes de caracterización citológica, y de citogenética, para cualquier otro examen celular o para extraer su material genético.

Esta recuperación es efectuada directamente en filtro y prácticamente sin pérdida de células buscadas. Se recogen, así, a menor coste, una gran proporción de la células consideradas, en buen estado, en condiciones compatibles con un cultivo de rutina en laboratorio. Las células aisladas pueden ser utilizadas antes o después del cultivo, para los exámenes de biología celular o molecular.

El dispositivo objeto de la presente invención permite también recoger de manera rápida y eficaz material celular de células particulares, por ejemplo, después de la realización:

- de una etapa de filtración en el transcurso de la cual el principal del líquido y de las otras citadas células pasa a través de un filtro cuyos microporos tengan un diámetro intermedio entre el de las células particulares y el de otras células, -de una etapa de lisis seguida o no de amplificación del ADN y/o del ARN en el citado compartimiento y -de una etapa de recuperación en el filtro del material genético de las células que hayan sido sometidas a lisis.

El dispositivo objeto de la presente invención presenta numerosas ventajas:

1/ la filtración puede ser efectuada sobre un soporte o sosteniendo el dispositivo con la mano, lo que representa una ganancia de tiempo y una economía de material importantes (se evitan, especialmente, una bomba de vacío y una carcasa de adaptación) , 2/ la filtración puede ser efectuada en el interior de una campana estéril, 3/ la filtración puede ser efectuada con el dispositivo en posición oblicua, incluso prácticamente horizontal, 4/ las condiciones están perfectamente estandarizadas, siendo... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para asilar células fijadas o vivas en un filtro (108, 308) , o extraer el material genético de las citadas células, que comprende:

- un compartimiento (102, 302) que presenta un volumen interior para recibir un líquido que comprende las citadas células, una abertura inferior y una entrada de aire, -un medio (110) móvil con respecto al compartimiento, presentando este medio móvil patas, -un filtro solidario, al menos temporalmente, de la citada abertura del compartimiento o del ciado medio móvil, adaptado para retener las citadas células durante el paso del líquido a través del filtro, -una aguja (180) solidaria, al menos temporalmente de la citada abertura del compartimiento, de manera estanca, encontrándose el filtro entre la aguja y el volumen interior del compartimiento, estando la citada aguja adaptada para perforar un tapón (186) de tubo de vacío (185) que presenta una depresión con respecto a la presión ambiente para aspirar el líquido a través del citado filtro, caracterizado por que comprende, además, un medio de unión (504, 520) entre el compartimiento y un cilindro de protección (502) que rodea a la aguja estando adaptado el citado medio de unión para rodear, al menos parcialmente, el tubo de vacío durante la aspiración del líquido a través del filtro, en el cual el medio móvil y el compartimiento están configurados para ser puestos en movimiento relativo para aplicar una fuerza sobre el filtro y liberar el filtro después de la aspiración del líquido a través del filtro, y en el cual las patas del medio móvil están configuradas para, cuando el dedo de un operario ponga en movimiento relativo el medio móvil y el compartimiento, ejercer una presión sobre un soporte del filtro y liberar el soporte de filtro de la abertura del compartimiento.

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, al menos provisionalmente, el cilindro de protección (502) .

3. Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el cual el citado medio de unión (504, 520) es provisional y permite la retirada conjunta del cilindro de protección (502) y del tubo de vacío (185) .

4. Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual el cilindro de protección (502) comprende una película desmontable (510) que obtura una abertura del cilindro de protección opuesta al medio de unión (504, 520) , abertura adaptada para la introducción del tubo de vacío (185) en el cilindro de protección después de la retirada de la película desmontable.

5. Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el soporte de filtro (108, 308) desmontable es de acero quirúrgico y está adaptado para ser solidarizado de manera temporal a la abertura inferior del compartimiento (102, 302) .

6. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el citado soporte de filtro (108, 308) está adaptado para permitir su paso por un escáner.

7. Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el cual el citado soporte de filtro (108, 308) lleva un identificador.

8. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un conector desmontable fijado al compartimiento de modo estanco y desmontable y adaptado para impedir el movimiento relativo del medio móvil y del compartimiento que permite aplicar la citada fuerza y liberar el citado soporte de filtro.

9. Procedimiento para aislar células vivas en un filtro (108, 308) o extraer el material genético de las citadas células, que comprende:

- una etapa (202, 402, 602) de solidarización, al menos temporal, de un filtro (108, 308) a una abertura inferior de un compartimiento (102, 302) que presenta, además, una entrada de aire, -una etapa (208, 405, 604) de inserción de un líquido que comprende las citadas células en el citado compartimiento, y -una etapa de solidarización (202, 402, 602) , al menos temporal, de una aguja (180) a la citada abertura del compartimiento, de manera estanca, encontrándose el filtro entre la aguja y el volumen interior del compartimiento, caracterizado por que comprende, además:

- una etapa (602) de fijación, al menos temporal, de un cilindro de protección (502) al compartimiento, rodeando entonces el cilindro de protección a la aguja, 13

- una etapa de perforación (210, 406, 605, 606) con la citada aguja, de un tapón (186) del tubo de vacío (185) que presenta una depresión con respecto a la presión ambiente, en el transcurso de la cual se inserta el tubo de vacío en el cilindro de protección, -una etapa de aspiración (210, 410, 610) , por medio de la depresión del tubo de vacío, del líquido a través de citado 5 filtro, reteniendo el citado filtro las citadas células, y -una etapa de puesta en movimiento relativo de un medio móvil que presenta patas y del compartimiento para aplicar una fuerza sobre el filtro y liberar el filtro después de la aspiración del líquido a través del filtro, ejerciendo las patas del medio móvil, cuando el dedo de un operario ponga en movimiento relativo el medio móvil y el compartimiento, una presión sobre un soporte del filtro y liberando el soporte de filtro de la abertura del compartimiento.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende una etapa (612) de retirada conjunta del cilindro de protección (502) y del tubo de vacío (185) .

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en el cual, comprendiendo el cilindro de protección (502) una película desmontable (510) que obtura una abertura del cilindro de protección

opuesta al medio de unión (504, 520) , el citado procedimiento comprende una etapa de retirada de la citada película desmontable antes de insertar el tubo de vacío en el cilindro de protección por la citada abertura antes de la inserción del tubo de vacío (185) en el cilindro de protección.