Virus influenza B que tienen alteraciones en el polipéptido hemaglutinina.

Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que comprende:

(a) introducir una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA de glicina a arginina en un genoma de virus influenza B que codifica para un polipéptido HA con un residuo de glicina en la posición 141; y

(b) replicar el genoma de virus influenza mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza B.

Virus influenza B que tienen alteraciones en el polipéptido hemaglutinina

Antecedentes de la invención Los virus influenza están constituidos por un núcleo interno de ribonucleoproteína que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta de lipoproteína externa cubierta por una proteína de matriz. Un ejemplo de una cepa de influenza es B/Jiangsu/10/03. Pueden recuperarse detalles de la cepa de influenza de B/Jiangsu/19/30 a través de www.fludb.org/brc/fluStrainDeatils.do?strainName=B/Jiangsu/10/03&detector=influenza. B/Jiansang/19/30 comprende una arginina en la posición de aminoácido 141 de la proteína HA. Los virus influenza A y B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. Los ocho segmentos genómicos de influenza B codifican para 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica para la proteína HA. El segmento 5 codifica para NP. El

segmento 6 codifica para la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de influenza B también codifica para dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica para dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm sometida a corte y empalme.

Se han producido vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para virus influenza durante más de 50 años. Las vacunas pueden caracterizarse como vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de antígeno de superficie y vacunas de virus atenuados vivos. Aunque las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacuna pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus atenuados vivos también pueden estimular inmunidad de la mucosa local en el tracto respiratorio.

FluMist™ es una vacuna atenuada viva que protege a niños y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1403-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44) . Las cepas de la vacuna FluMist™ contienen los segmentos génicos de HA y NA derivados de las cepas de tipo natural circulantes actualmente junto con seis segmentos génicos internos de un virus donador maestro (MDV) común. Chen et al. (2006) , Virology.; 345 (2) :416-23 describen el mapeo genético del fenotipo adaptado al frío de B/Ann Arbor/1/66, el virus donador maestro para vacunas con influenza atenuado vivo (FluMist) .

Hasta la fecha, las vacunas contra la gripe disponibles comercialmente en los Estados Unidos se propagan en huevos embrionados de gallina. Muchas cepas de virus influenza B no crecen bien en huevos y deben “adaptarse al huevo”. Desgraciadamente, la adaptación al huevo de los virus influenza B da como resultado la pérdida de un sitio de glicosilación unido a N en el residuo de aminoácido 196 ó 197 del polipéptido HA. La pérdida del sitio de glicosilación unido a N afecta a la antigenicidad del virus y de manera correspondiente a la eficacia de la vacuna. La estabilización del sitio de glicosilación unido a N en virus influenza B hechos crecer en huevos podría ser de importancia en, entre otros, la fabricación de una vacuna contra la gripe B. Por ejemplo, Lugovtsev et al. (2007) , Virology; 365 (2) :315-23 describen que se ha encontrado en estudios previos que la adaptación de la cepa B/Victoria/504/2000 a alto crecimiento en huevos estaba asociada con cambios sólo en hemaglutinina (HA) . El fenotipo de alto crecimiento se asoció con la adquisición de o bien dos (R162M y D196Y) o bien tres (G141E,

R162M y D196Y) sustituciones de aminoácido (AA) , que se pronosticó que estarían cerca del dominio de unión al receptor de HA. Logovtsev et al. (2007) describen la contribución al crecimiento del virus de cada una de estas sustituciones de AA y determinaron su efecto sobre las propiedades antigénicas. Se encontró que G141E y R162M eran las más favorables para el crecimiento del virus; sin embargo, sólo R162M pudo mejorar el crecimiento del virus sin alteración antigénica. En Nakagawa et al. (2003) , J Gen Virol; 84 (4) :769-73, se usaron dos anticuerpos monoclonales para seleccionar mutantes de escape (definidos por su falta de reactividad frente a los anticuerpos monoclonales) de las cepas del grupo Yamagata del virus influenza B. El análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas identificó una sustitución de aminoácido individual en el residuo 141 (Gly->Arg) o 149 (Arg->Gly) en los mutantes de escape 5H4 y 141 (Gly->Arg) , 147 (Thr->Ile) o 148 (Ser->Gly) en los mutantes de escape 3A12.

Sumario de la invención La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La invención engloba un método de preparación de un virus influenza B tal como se define mediante la reivindicación 1. Se introduce una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA por arginina en un genoma de virus influenza B. Se replica el genoma de virus influenza B mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza B.

La invención también engloba un método de preparación de un virus influenza B tal como se define mediante la reivindicación 3. Se introduce una pluralidad de vectores en una población de células huésped. Los vectores 65 comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a: (a) al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza B, y (b) uno o más segmentos genómicos que codifican para los polipéptidos HA y NA de

al menos una segunda cepa de influenza B. El polipéptido HA comprende una arginina en el residuo de aminoácido 141. La población de células huésped se cultiva a una temperatura que no supera los 35 grados. Se recupera el virus influenza.

Breve descripción de los dibujos Figura 1: Ilustración del plásmido pAD3000.

Figura 2: Ilustración de un sistema de ocho plásmidos para la producción de virus influenza B.

Figura 3A-D: A y B, caracterización de virus MDV-B recombinante mediante RT-PCR; C y D, caracterización de B/Yamanashi/166/98 recombinante mediante RT-PCR.

Figura 4A y B: Secuencia de pAD3000 en formato de GeneBank (SEQ ID NO: 3) .

Figura 5A -AE: Alineación de secuencias con MDV-B y ocho plásmidos, A-E, segmento PB1 (SEQ ID NO: 4) ; F-J, segmento PB2 (SEQ ID NO: 5) ; K-O, segmento PA (SEQ ID NO: 6) ; P-S, segmento HA (SEQ ID NO: 7) ; T-W, segmento NP (SEQ ID NO: 8) ; X-Z, segmento NA (SEQ ID NO: 9) ; AA-AC, segmento M (SEQ ID NO: 10) ; AD-AE, segmento NS (SEQ ID NO: 11) .

Figura 6: Productos de RT-PCR derivados de la amplificación simultánea de los segmentos HA y NA de cepas de influenza B.

Figura 7: Gráfico de barras que ilustra títulos relativos de virus recombinantes y reordenantes.

Figura 8: Ilustración esquemática de recombinantes de genes triples con residuos de tipo natural en proteínas PA, NP y M1.

Figura 9: Tabulación de crecimiento de virus recombinantes de genes individuales y genes dobles.

Figura 10: Tabulación de los residuos de aminoácido de la nucleoproteína que corresponden al fenotipo no ts.

Figura 11: Gráficos de barras que ilustran la replicación diferencial de virus reordenantes. Los recuadros grises representan residuos de aminoácido de tipo natural. La línea discontinua representa la temperatura de desactivación (ts) de 2, 0 log10.

Figura 12: Alineación de las secuencias de HA cerca del sitio de glicosilación en 196/197 de varias cepas de influenza B amplificadas en huevos. Se alinean los virus del linaje Victoria con la cepa de referencia B/Victoria/2/87 (SEQ ID NO: 12) . Se alinean los virus del linaje Yamagata con B/Yamagata/16/88 (SEQ ID NO: 13) . En la alineación sólo se muestran los residuos que difieren de la cepa de referencia. El posible sitio de N-glicosilación (N-X-T/S) en la posición de 196/197 se indica subrayado y en forma de flecha. “.” indica deleción de aminoácido en los linajes B/Yamagata. “x” indica aminoácido mixto.

Figura 13: Confirmación de la glicosilación de HA mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se sometieron a 45 electroforesis B/Shanghai/361/02 6:2 (B/SH) , B/Jilin/20/03 6:2 (B/JL) y B/Jiangsu/10/03 6:2 (B/JS) con la secuencia 196-199 indicada en SDS-PAGE al 10%. Se detectaron las proteínas HA1 y HA2 mediante inmunotransferencia de tipo Western... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que comprende: 5

(a) introducir una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA de glicina a arginina en un genoma de virus influenza B que codifica para un polipéptido HA con un residuo de glicina en la posición 141; y

(b) replicar el genoma de virus influenza mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza B.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de introducción se realiza mediante mutagénesis dirigida al sitio.

3. Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que comprende:

(a) introducir una mutación en un vector de una pluralidad de vectores, en el que el vector comprende secuencias de nucleótidos que corresponden al segmento genómico que codifica para HA, y

en el que la mutación da como resultado arginina en el residuo de aminoácido 141;

(b) introducir en una población de células huésped una pluralidad de vectores, comprendiendo dichos vectores secuencias de nucleótidos que corresponden a: 25

(i) al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza B; y

(ii) uno o más segmentos genómicos que codifican para los polipéptidos HA y NA de al menos una segunda cepa de

influenza B, en el que el polipéptido HA comprende una arginina en el residuo de aminoácido 141; 30

(c) cultivar la población de células huésped a una temperatura que no supera los 35 grados; y

(d) recuperar el virus influenza.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el primer virus influenza B tiene uno de los siguientes atributos: sensibilidad a la temperatura, atenuación o adaptación al frío; o en el que el primer virus influenza B comprende los residuos de aminoácido: PB2630 (630R) ; PA431 (431M) ; PA497 (497H) ; NP55 (55A) ; NP114 (114A) ; NP410 (410H) ; NP510 (510T) ; M1159 (159Q) y M1183 (183V) .

5. Método según la reivindicación 3, en el que el primer virus influenza B es la cepa B/Ann Arbor/1/66.

6. Método según la reivindicación 3, en el que las células son una de células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 o células COS.

7. Método según la reivindicación 3, en el que los vectores son plásmidos.

8. Método según la reivindicación 3, en el que el método es independiente del uso de un virus auxiliar.

9. Método según la reivindicación 3, en el que la temperatura es de entre 30 y 35 grados o es de entre 32 y 35 50 grados.

10. Método según la reivindicación 3, que comprende además replicar el virus influenza recuperado en huevos; en el que el virus influenza replicado en huevos conserva el sitio de glicosilación en la posición de residuo de aminoácido 196/197 de HA; y en el que el virus influenza se replica hasta al menos un título pico de 7, 0 log10 UFP/ml en los 55 huevos.