Vector con genes de codones optimizados para una vía metabólica de arabinosa para la conversión de arabinosa en levadura para la producción de etanol.

Una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende tres secuencias de ácido nucleico cada una de las cuales codifica un polipéptido de una vía metabólica bacteriana de L-arabinosa,

donde las tres secuencias de ácido nucleico son araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (Lribulosa-5-P-4-epimerasa), donde la secuencia de ácido nucleico para araA se obtiene de Bacillus licheniformis o Clostridium acetobutylicum, y donde la célula hospedadora es una célula fúngica.

Vector con genes de codones optimizados para una vía metabólica de arabinosa para la conversión de arabinosa en levadura para la producción de etanol

1. Resumen La presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen nuevos casetes de expresión y vectores de expresión, que comprenden tres secuencias de ácido nucleico para araA, araB y araD, que codifican cada una un polipéptido de una vía metabólica bacteriana de L-arabinosa. La invención particularmente se refiere a células hospedadoras que contienen casetes de expresión y vectores de expresión, que comprenden secuencias de ácido nucleicos de codones optimizados para araA, araB y araD. Las células hospedadoras son, en particular, cepas modificadas de levadura que expresan los polipéptidos para la vía metabólica bacteriana de L-arabinosa. Cuando se usan estas células hospedadoras modificadas, la arabinosa se fermenta de forma más eficaz por estas células, en particular en etanol. La presente invención por lo tanto es relevante, entre otras cosas, en relación a la producción de agentes bioquímicos a partir de biomasa, tal como bioetanol, por ejemplo.

2. Antecedentes de la invención La levadura de la cerveza, del vino y del pan Saccharomyces cerevisiae se ha usado ya durante siglos para la producción de pan, vino y cerveza debido a su característica de fermentar azúcar en etanol y dióxido de carbono. En biotecnología, S. cerevisiae se usa particularmente en la producción de etanol para fines industriales, además de la producción de proteínas heterólogas. El etanol se usa en numerosas ramas de la industria como sustrato inicial para síntesis. El etanol está adquiriendo una importancia crecimiento como combustible alternativo, debido a la presencia cada vez más escasa de petróleo, los crecientes precios del petróleo y la necesidad continuamente creciente de combustible en todo el mundo.

Para producir bioetanol de forma barata y eficaz, se plantea en sí mismo el uso de biomasa que contiene lignocelulosa, tal como por ejemplo paja, residuos de la industria maderera y la agricultura y el componente orgánico de los residuos domésticos diarios, como sustrato inicial. En primer lugar, dicha biomasa es muy conveniente y en segundo lugar está presente en grandes cantidades. Los tres componentes principales de la lignocelulosa son la lignina, la celulosa y la hemicelulosa. La hemicelulosa, que es el segundo polímero que existe de forma más frecuente después de la celulosa, es un heteropolímero muy ramificado. Consta de pentosas (L-arabinosa, D-xilosa) , ácidos urónicos (ácido 4-O-metil-D-glucurónico, ácido D-galacturónico) y hexosas (D-manosa, D-galactosa, Lramnosa, D-glucosa) (véase la Figura 1) . Aunque la hemicelulosa puede hidrolizarse más fácilmente que la celulosa, sin embargo contiene las pentosas L-arabinosa y D-xilosa, que normalmente no pueden convertirse por la levadura S. cerevisiae.

Para ser capaces de usar pentosas para fermentaciones, primero deben penetrar en la célula a través de la membrana plasmática. Aunque S. cerevisiae no es capaz de metabolizar D-xilosa, puede captar D-xilosa en el interior de la célula. Sin embargo, S. cerevisiae no tiene un transportador específico. El transporte tiene lugar mediante numerosos transportadores de hexosa. La afinidad de los transportadores por D-xilosa es, sin embargo, claramente inferior que por D-glucosa (Kotter y Ciriacy, 1993) . En levaduras que son capaces de metabolizar Dxilosa, tales como por ejemplo P. stipitis, C. shehatae o P. tannophilus (Du Preez et al., 1986) , existen tanto transportadores de baja afinidad no específicos, que transportan D-glucosa, como también simportadores de protones de alta afinidad específicos solamente para D-xilosa (Hahn-Hagerdal et al., 2001) .

En experimentos anteriores, se descubrieron algunas levaduras, tales como por ejemplo Candida tropicalis, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae, que de forma natural fermentan L-arabinosa o al menos pueden asimilarla. Sin embargo, estas levaduras carecen completamente de la capacidad de fermentar L-arabinosa en etanol, o solamente obtienen un rendimiento muy bajo de etanol (Dien et al., 1996) .

Conversión de L-arabinosa Para que la pentosa L-arabinosa se metabolice por S. cerevisiae, debe entrar en la célula mediante proteínas de transporte y convertirse en el metabolito D-xilulosa-5-fosfato en tres etapas enzimáticas. Estas tres etapas enzimáticas pueden quedar a disposición de la levadura mediante genes expresados de forma heteróloga. La Dxilulosa-5-fosfato funciona como intermedio de la vía de pentosa fosfato y puede descomponerse adicionalmente para producir etanol en condiciones anaeróbicas en la célula (véase la figura 2) .

Becker y Boles (2003) describen el diseño por ingeniería y la selección de una cepa de laboratorio de S. cerevisiae que es capaz de usar L-arabinosa para el crecimiento y para fermentarla en etanol. Esto fue posible debido a la sobre-expresión de una vía metabólica bacteriana de L-arabinosa, que consta de AraA de Bacillus subtilis y AraB y AraD de Escherichia coli y la sobre-expresión simultánea de la permeasa de levadura de galactosa que transporta Larabinosa en la cepa de levadura. El análisis molecular de la cepa seleccionada mostró que la precondición predeterminante para el uso de L-arabinosa es una menor actividad de L-ribuloquinasa. Sin embargo, entre otras

cosas, se ha constatado un crecimiento muy lento a partir de esta cepa de levadura (véase la Figura 2) .

El documento WO 2006/096130 A1 (Boles et al.) describe cepas de S. cerevisiae que fermentan arabinosa y xilosa, que contienen los genes de la vía metabólica de xilosa y arabinosa, donde la vía metabólica de arabinosa consta de los genes para la L-arabinosa isomerasa (araA) de B. subtilis, la L-ribuloquinasa (araB) de E. coli y la L-ribulosa-5-P4-epimerasa (araD) de E. coli.

El documento WO 98/50524 A1 describe el desarrollo de plásmidos que contienen los genes de E. coli de la vía metabólica de xilosa y arabinosa, en particular la xilosa isomerasa, xiluloquinasa, L-arabinosa isomerasa, Lribuloquinasa y L-ribulosa-5-P-4-epimerasa, transaldolasa y transcetolasa. Los plásmidos se usan para la transformación de cepas de Zymomonas, para posibilitar que estas cepas transformadas crezcan en xilosa y arabinosa y las conviertan en etanol.

Hasta ahora, solamente era posible expresar los genes nativos de las vías metabólicas bacterianas de arabinosa que son esenciales para metabolizar la arabinosa en S. cerevisiae en plásmidos individuales o integrarlos individualmente en el genoma de levadura, respectivamente (Karhumaa et al., 2006) . Esto significa que cada transformante de levadura con una vía metabólica funcional de arabinosa contenía al menos tres plásmidos o los genes integrados en el locus de ADNr (Becker y Boles, 2003; Karhumaa et al., 2006) .

La presencia de los genes en diferentes plásmidos está asociada con varias desventajas. Por un lado, los plásmidos que están presentes simultáneamente representan un estrés adicional para las células de levadura ("Plasmid stress", Review of E. coli por Bailey (1993) ) . Por otro lado, los plásmidos usados tienen fuertes homologías en sus secuencias, que pueden conducir a la pérdida de información dentro de los plásmidos debido a recombinación homóloga (Wiedemann, 2005) . Sin embargo, las desventajas principales asociadas con el uso de plásmidos recaen en el hecho de que permanecen inestables en las cepas sin presión selectiva y que no son adecuados para uso industrial.

Además, sería ideal para aplicaciones industriales que el microorganismo usado fuera capaz de metabolizar todos los azúcares presentes en el medio. Como las levaduras actualmente usadas de forma industrial no son capaces de metabolizar la arabinosa en el medio, sería muy ventajoso proporcionar a cepas esta capacidad adicional de una forma estable.

El documento WO 03/008593 A2 muestra la secuencia de aminoácidos de una L-Arabinosa isomerasa (araA) de Clostridium acetobutylicum (SEC ID Nº 9) . Noelling et al. (2001) describen la secuencia genómica y el análisis comparativo de la bacteria productora de disolvente Clostridium acetobutylicum, a partir de la cual se clonó araA genómica.

En la base de datos NCBI, el Nº de acceso AAU41894 muestra la secuencia de aminoácidos de una L-Arabinosa isomerasa (araA) de Bacillus licheniformis ATCC 14580. Veith et al. (2004) describen la secuencia completa de ácido nucleico de Bacillus licheniformis DSM13, a partir de la cual se clonó araA genómica.

El objetivo de la presente invención, por lo tanto, es proporcionar medios que superen las desventajas conocidas de la técnica anterior para introducir genes de una vía... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende tres secuencias de ácido nucleico cada una de las cuales codifica un polipéptido de una vía metabólica bacteriana de L-arabinosa,

donde las tres secuencias de ácido nucleico son araA (L-arabinosa isomerasa) , araB (L-ribuloquinasa) y araD (Lribulosa-5-P-4-epimerasa) , donde la secuencia de ácido nucleico para araA se obtiene de Bacillus licheniformis o Clostridium acetobutylicum, y donde la célula hospedadora es una célula fúngica.

2. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1, que es una célula de levadura, tal como especies de Saccharomyces, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. o Yarrowia sp.

3. La célula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, donde la secuencia de ácido nucleico para araB

y la secuencia de ácido nucleico para araD son originarias de E. coli. 15

4. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia de ácido nucleico para araA comprende una secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 3, 4 ó 5.

5. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos dos de 20 las tres secuencias de ácido nucleico están optimizadas en los codones para su uso en una célula hospedadora.

6. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ácido nucleico para araB comprende una secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 1, y/o donde la secuencia de ácido nucleico para araD comprende una secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº

2.

7. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 1, la secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 2 y la secuencia de ácido nucleico con las SEC ID Nº 3, 4 ó 5.

8. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la célula hospedadora contiene la molécula de ácido nucleico integrada de un modo genómicamente estable.

9. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de 35 ácido nucleico comprende ADNbc, ADNmc, APN, ACN, ARN o ARNm o combinaciones de los mismos.

10. La célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de ácido nucleico está comprendida en un casete de expresión o en un vector de expresión.

11. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10, donde el casete de expresión comprende secuencias promotoras y terminadoras, o comprende diferentes pares de secuencias promotoras y terminadoras, respectivamente.

12. Un método para producir bioetanol, que comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico, definida en 45 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Uso de una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para producir

bioetanol o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa. 50