Variantes de la hemaglutinina y la neuraminidasa de influenza.

Un virus influenza reagrupado, en el que dicho virus comprende 6 segmentos internos del genoma de uno o más virus donadores diferentes de A/Ann Arbor/6/60 y un primer segmento del genoma y un segundo segmento del genoma,

en el que el primer segmento del genoma codifica un polipéptido HA que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 15 y en el que el segundo segmento del genoma codifica un polipéptido NA que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 16.

Variantes de la hemaglutinina y la neuraminidasa de influenza Antecedentes de la invención

Las vacunas contra diversas cepas en evolución de Influenza son importantes desde un punto de vista de salud pública, así como comercialmente, puesto que cada año numerosos individuos se infectan con diferentes cepas y tipos de virus influenza. Los lactantes, ancianos y aquellos que tienen una atención sanitaria inadecuada y personas inmunocomprometidas corren un riesgo especial de muerte portales infecciones. El problema de las infecciones por influenza se agrava porque las cepas de influenza novedosas evolucionan rápidamente y pueden propagarse entre diversas especies, necesitando de ese modo la producción continua de nuevas vacunas.

Se han producido numerosas vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para tales cepas de virus/virus influenza diferentes durante más de 50 años e incluyen vacunas de virus completo, vacunas de virus dividido, vacunas de antígeno de superficie y vacunas de virus atenuado vivo. Sin embargo, aunque formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacunas pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus atenuado vivo tienen la ventaja de también poder estimular la inmunidad mucosa local en el aparato respiratorio. Se ha realizado un considerable trabajo por los presentes inventores y colaboradores en la producción de virus influenza, y fragmentos de los mismos, para la producción de vacunas; véanse, por ejemplo, los documentos US 2004029251 y US 2005042229.

Debido a la continua aparición (o reaparición) de cepas de influenza diferentes, se desean continuamente nuevas vacunas contra influenza. Normalmente, tales vacunas se crean usando restos antigénicos de las cepas de virus recién aparecidas, por tanto, se desean altamente polipéptidos y polinucleótidos de cepas de virus novedosas, recién aparecidas o recién reaparecidas (especialmente secuencias de genes antigénicos).

El documento de Subbarao K et al. (2003), Virology, vol. 305, págs. 192-200 describe la evaluación de un candidato como vacuna contra el virus influenza A H5N1 reagrupado genéticamente modificado.

El documento de Li S et al. (1999), J. infect. Dis., vol. 179, págs. 1132-1138 describe virus influenza con reagrupamiento 6:2 como vacunas candldatas contra los virus A/HK/97 (H5N1) patógenos humanos.

El documento de Bender C ef al. (1999), Virology, vol. 254, págs. 115-123 describe una caracterización de las proteínas superficiales de los virus Influenza A (H5N1) aislados de humanos en 1997-1998.

La entrada AF084275 en la base de datos de secuencias describe la secuencia de un segmento que codifica la neuraminidasa N1 de un virus Influenza A A/HongKong/486/97 (H5N1).

La entrada Q9WDG1 en la base de datos de secuencias describe la secuencia de un fragmento de hemaglutinina de una cepa aislada del virus Influenza A A/HK/485/97.

La entrada Q9QSJ8 en la base de datos de secuencias describe la secuencia de un fragmento de hemaglutinina de una cepa aislada del virus Influenza A A/HK/485/97.

El documento de Wareing M ef al. (2001), J. Medie. Virol., vol. 65, págs. 171-177 describe A/Lenlngrad/134/17/57 como la cepa vírica donadora maestra.

La presente descripción proporciona vahantes de la hemaglutinina y la neuraminidasa de influenza nuevas y/o recién aisladas que son útiles en la producción de numerosos tipos de vacunas así como en investigación, diagnóstico, etc. Otros numerosos beneficios resultarán evidentes tras la revisión de lo siguiente.

Sumario de la invención

La Invención allí descrita es un pollpéptldo aislado o recomblnante que se selecciona de: los polipéptidos codificados por una cualquiera de las secuencias de SEC ID N° 1 a SEC ID N° 10, uno cualquiera de los polipéptidos codificados por las SEC ID N° 1 a SEC ID N° 10; uno cualquiera de los polipéptidos de las SEC ID N° 1 a SEC ID N° 20; sólo los marcos de lectura abiertos de los polipéptidos de las SEC ID N° 11 de SEC ID N° 20; formas alternativas (por ejemplo, la forma madura sin el péptldo señal, o sin las secuencias 5 y 3 fuera del marco de lectura abierto, o las secuencias tal como se expresan en la superficie de un virus (por ejemplo, influenza)) de los polipéptidos de SEC ID N° 11-20.

Los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden opcionalmente proteínas de fusión, proteínas con una secuencia líder, un polipéptido precursor, proteínas con una señal de secreción o una señal de localización, o proteínas con una etiqueta de epítopo, una etiqueta de E o una etiqueta de epítopo de Hls. Las secuencias descritas

en el presente documento también se muestran en el apéndice 1 y en las listas de secuencias en el presente documento. Las secuencias de hemaglutlnlna descritas en el presente documento pueden comprender secuencias con sitios de escisión polibásicos modificados (que permiten de ese modo el crecimiento de los virus en huevos). Las secuencias de polipéptido de hemaglutlnlna de SEQ ID Nos 11-20 comprenden las secuencias de péptldo señal amino terminal endógenas, sin embargo, las secuencias de polipéptido de hemaglutlnlna descritas en el presente documento también incluyen la forma madura (péptldo señal amino terminal escindido) de los pollpéptldos de hemaglutinina. Los sitios de escisión de cualquier secuencia de polipéptido de hemaglutlnlna de cualquier cepa de influenza pueden predecirse o medirse rutinariamente usando cualquiera de varios métodos en la técnica.

También se describe en el presente documento una composición con uno o más pollpéptldos enumerados anteriormente, o fragmentos de los mismos. Se describen además en el presente documento pollpéptldos a los que se une específicamente un antisuero pollclonal generado contra al menos 1 antfgeno que comprende al menos una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente, o un fragmento de la misma. Tales anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos anteriormente también se describen en el presente documento. Los pollpéptldos descritos en el presente documento son opclonalmente ¡nmunogénlcos.

Se describen además composición ¡nmunogénlcas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más de cualquiera de los pollpéptldos descritos anteriormente así como métodos para estimular el sistema ¡nmunitario de un individuo para producir una respuesta ¡nmunltaria protectora contra virus influenza administrando al Individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos anteriores en un vehículo fisiológicamente aceptable.

La Invención incluye virus influenza recomblnante tal como se caracteriza mediante las reivindicaciones adjuntas que comprende uno o más de los polipéptidos o pollnucleótldos anteriores, además de composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de tal virus influenza recombinante. El virus Influenza recombinante de la invención para su uso en un método para la estimulación del sistema ¡nmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora contra virus influenza, a través de la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de tal virus influenza recombinante en un vehículo fisiológicamente aceptable también es parte de la invención.

También se describe en el presente documento una composición de materia que tiene dos o más ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, una biblioteca que comprende al menos aproximadamente 2, 5, 10, 50 o más ácidos nucleicos). Tales composiciones pueden producirse opcionalmente escindiendo uno o más ácido(s) nucleico(s) descrito(s) anteriormente, (por ejemplo, de manera mecánica, química, enzimática con una endonucleasa de restricción/ARNasa/ADNasa, etc.). Otras composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones producidas incubando uno o más de los ácido(s) nucleico(s) descrito(s) anteriormente en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato y una ácido nucleico polimerasa termoestable.

También se describen en el presente documento células que comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, o un producto o fragmento amplificado o escindido de los mismos. Tales células pueden expresar opclonalmente un polipéptido codificado por tal ácido nucleico. Se describen además en el presente documento vectores (por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, fragmentos de virus, etc.) que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Tales vectores pueden comprender opcionalmente un vector de expresión. Los vectores de expresión preferidos incluyen, pero no se limitan a, vectores que comprenden el promotor de pol I y... [Seguir leyendo]

1. Un virus influenza reagrupado, en el que dicho virus comprende 6 segmentos internos del genoma de uno o más virus donadores diferentes de A/Ann Arbor/6/60 y un primer segmento del genoma y un segundo segmento del

genoma, en el que el primer segmento del genoma codifica un polipéptido HA que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 15 y en el que el segundo segmento del genoma codifica un polipéptido NA que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 16.

2. El virus influenza reagrupado de la reivindicación 1, en el que dicho primer segmento del genoma comprende un 10 polinucleótido de la SEQ ID N° 5 que codifica el polipéptido HA.

3. El virus influenza reagrupado de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho virus tiene una o más de las siguientes propiedades: sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío o atenuación.

4. El virus influenza reaqrupado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho o dichos virus donadores son PR8.

5. El virus influenza reagrupado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho o dichos virus donadores

son A/Leningrad/134/17/57.

6. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza reagrupado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El virus influenza reagrupado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en un método de tratamiento 20 mediante la estimulación del sistema inmunitario de un individuo para que produzca una respuesta inmunitaria

protectora contra el virus influenza, en el que el virus influenza reagrupado debe administrarse al sujeto en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un vehículo fisiológicamente eficaz.

8. El virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en un método profiláctico de tratamiento de una infección viral en un sujeto, en el que el virus debe administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para producir una

respuesta inmunogénica contra la infección viral.

9. Una vacuna con virus divididos o virus muertos que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación 6.

10. El virus de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho virus está muerto o inactivado.

11. Una vacuna contra el virus influenza atenuado vivo que comprende la composición inmunogénica de la

reivindicación 6.

12. Un método para producir virus influenza en cultivos celulares, comprendiendo el método:

i) introducir en una población de células huésped que es capaz de soportar replicación del virus influenza, una 35 pluralidad de vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden al menos a 6 segmentos

internos de un virus donador diferente de A/Ann Arbor/6/60, y un primer segmento del genoma y un segundo segmento del genoma codificantes de antígenos superficiales de influenza inmunogénicos de una cepa de influenza pandémica, en el que el primer segmento del genoma codifica un polipéptido de hemaglutinina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 15, en el que el segundo segmento del genoma codifica un polipéptido 40 NA que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 16;

ii) cultivar la población de células huésped en presencia de tripsina a una temperatura inferior o igual a 35 °C; y

iii) recuperar una pluralidad de virus influenza.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho primer segmento del genoma comprende un polinucléotido de la SEQ ID N° 5 que codifica el polipéptido HA.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en el que los seis segmentos internos del genoma del virus donador codifican uno o más atributos fenotípicos seleccionados del grupo que consiste en: atenuación, adaptación al frío y

sensibilidad a la temperatura.

15. Un virus influenza reagrupado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en la inmunización de un sujeto contra una infección por el virus influenza.