Vacuna bacteriana contra agentes infecciosos bacterianos para la aplicación en animales.

Vacuna bacteriana para la aplicación en un animal, en particular un animal útil,

que comprende al menos un serotipo del organismo Salmonella enterica con al menos respectivamente una mutación de desactivación en al menos tres genes cromosómicos distintos, comprendiendo el al menos un serotipo Salmonella Typhimurium con al menos una mutación de desactivación en un gen que codifica la proteína OmpD.

Vacuna bacteriana contra agentes infecciosos bacterianos para la aplicación en animales La invención se refiere a una vacuna bacteriana de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1 y a un procedimiento para su producción de acuerdo con la reivindicación 3. Además, la invención se refiere a una bacteria de acuerdo con la reivindicación 4, a una proteína inmunógena de acuerdo con la reivindicación 7, a su uso de acuerdo con la reivindicación 10 y a un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 11.

En la explotación agraria de animales útiles, en particular en explotaciones porcinas, las afecciones de las vías respiratorias y las infecciones del aparato gastrointestinal son responsables de considerables daños económicos. Las afecciones no solamente causan una elevada mortalidad, índices de crecimiento reducidos y una peor calidad de la carne, sino que también son responsables de más de la mitad de todos los tratamientos antibióticos en el sector de la explotación de cerdos de engorde (Elbers et al., 1990, Sero-epidemiological screening of pig sera collected at the slaughterhouse to detect herds infected with Aujeszky's disease virus, porcine influenza virus and Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae in the framework of an integrated quality control system. Vet.Q. 12, 221-230) .

Las vacunas, en particular contra infecciones bacterianas, en la explotación agraria de animales útiles se emplean casi en exclusiva de forma metafiláctica y no profiláctica. A este respecto, en el centro de las medidas se encuentra la cabaña y no el animal individual. De este modo se vacunan en particular cabañas en las que es endémico un patógeno contra este patógeno, independientemente de si un animal individual ya está infectado o no.

Las vacunas usadas actualmente en veterinaria contra agentes infecciosos bacterianos son, sobre todo, bacterinas formuladas con adyuvante sencillas, por ejemplo, bacterias completas inactivadas con formalina. En este caso, por un adyuvante se ha de entender una sustancia que se administra como mezcla con una sustancia (antígeno) , que desencadena una respuesta inmune y que induce anticuerpos, o por separado de la misma y, de forma inespecífica, aumenta o modifica la respuesta inmune a este antígeno. Causan una protección frecuentemente serotípica frente a afecciones clínicas, sin embargo, sin impedir una colonización latente de las mucosas. Por ello, el agente infeccioso se puede continuar propagando también por animales vacunados.

Los patógenos más significativos de enfermedades infecciosas respiratorias, tales como Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae o Mycobacterium bovis, son altamente contagiosos y aparecen frecuentemente como colonizadores latentes de mucosas del tracto respiratorio. En particular, A. pleuropneumoniae y M. hyopneumoniae tienen en común que los animales convalecientes siguen siendo frecuentemente durante meses portadores del patógeno. Por ello, respaldado por el comercio con animales y transportes de animales, se ha producido una extensa propagación de los patógenos. Las vacunas que se encuentran actualmente en el mercado son, casi en exclusiva, bacterianas. Ninguna de las vacunas evita una infección latente ni permite una diferenciación entre animales vacunados e infectados.

Las infecciones por Salmonella Typhimurium representan, bajo el punto de vista de la protección sanitaria del consumidor, la afección más importante del aparato gastrointestinal en cerdos. Actualmente hay vacunas en el mercado contra la salmonelosis de los terneros y contra la colonización por salmonelas de los cerdos y de las gallinas ponedoras. En todos los casos están disponibles también o exclusivamente vacunas vivas atenuadas. En terneros se evita de forma eficaz, gracias a la vacunación, la aparición de manifestaciones clínicas. En gallinas ponedoras se reduce claramente la transmisión intraovárica así como la excreción del patógeno, en cerdos se reduce la excreción del patógeno.

Las vacunas vivas admitidas contra salmonelas incluyen patógenos atenuados producidos mediante mutaciones químicas que se pueden diferenciar genotípica y fenotípicamente de la cepa natural. Pero no es posible una diferenciación serológica de animales vacunados e infectados en el caso de la aplicación de estas vacunas.

Por tanto, las vacunas de bacterinas actuales no permiten ninguna diferenciación serológica de animales útiles vacunados e infectados, por ejemplo, mediante aplicación de un ensayo ELISA. Por tanto, no es posible crear, con ayuda de estas vacunas, cabañas libres de patógenos especificados (SPF) y mantenerlas controlables bajo protección vacunal. La generación de cabañas SPF, sin embargo, es el ivo ideal en el sentido de la protección preventiva del consumidor y la rentabilidad.

Además es problemático vacunar cerdos en explotaciones controladas en cuanto a salmonelas ( (BMVEL 1996; Leitlinie zur Reduzierung des Eintrags von Salmonellen durch Schlachtschweine in die Fleischgewinnung; un reglamento correspondiente está en preparación) , ya que la clasificación y supervisión de estas explotaciones se realiza a través de la serología y los animales vacunados reaccionan serológicamente de forma positiva.

El fin de la generación de cabañas SPF se ha conseguido para la enfermedad de Aujeszky en cerdos (causada por el virus herpes porcino I) y en infecciones de bovinos por el virus herpes bovino 1 (BHV1) mediante la inclusión de vacunas marcadoras. Las vacunas marcadoras se basan en cepas vacunales estructuralmente modificadas que

posibilitan una diferenciación, por norma general serológica, de animales vacunados e infectados de forma natural. Se diferencia entre vacunas de marcador positivo y negativo.

Para la producción de vacunas de marcador positivo se introduce, por norma general, un antígeno marcador mediante ingeniería genética en la cepa vacunal, que por norma general induce la formación de anticuerpos adicionales o, al menos, se puede comprobar genotípica o fenotípicamente. Es desventajoso que las infecciones posteriores por un agente infeccioso nativo después de una vacunación, es decir, vacunado más infectado, ya no se pueden comprobar. Por tanto, la vacuna de marcador positivo solamente permite la diferenciación de animales no vacunados, no vacunados más infectados y vacunados.

Las vacunas de marcador negativo están caracterizadas por que al genoma del patógeno le falta una región definida del genoma. Estas mutaciones se pueden producir por vía natural o mediante ingeniería genética. La ausencia de una sección definida de un gen que codifica una proteína inmunógena conduce a la modificación de la respuesta inmune humoral, que permite una diferenciación entre animales solamente infectados, solamente vacunados y vacunados más infectados. No es posible una delimitación de animales vacunados más infectados y solamente infectados, siendo, sin embargo, esta delimitación médica y económicamente irrelevante. La ventaja de vacunas de marcador negativo sin ADN extraño además es que, ciertamente se trata de organismos modificados genéticamente, pero que no se incluyen en la ley alemana sobre ingeniería genética.

Para prevenir y combatir enfermedades infecciosas bacterianas en animales útiles, sin embargo, a diferencia del sector de las enfermedades infecciosas víricas, hasta la fecha no se han desarrollado de forma específica vacunas de marcador.

KOTLOFF K L ET AL: "Shigella flexneri 2a strain CVD 1207, with specific deletions in virG, sen, set, and guaBA, is highly attenuated in humans". INFECTION AND IMMUNITY MAR 2000, tomo. 68, Nº 3, marzo 2000 (2000-03) , páginas 1034-1039, XP002454965 ISSN: 0019-9567 describe una vacuna de la cepa CVD 1207 de Shigella flexneri 2a (Enterobacteriaceae) con mutaciones de deleción específicas en los genes virG, sen, set y guaBA.

El artículo de revisión MASTROENI P ET AL: "Salmonella: immune responses and vaccines". VETERINARY JOURNAL (LONDON, ENGLAND: 1997) MAR 2001, tomo 161, Nº 2, marzo 2001 (200103) , páginas 132-164, XP002454966 ISSN: 1090-0233 describe la facilitación de vacunas contra infecciones por salmonela. Se describen como vacunas adecuadas distintos mutantes de simples a triples. En una tabla están indicadas diversas dianas génicas.

MEYER P N ET AL: "Virulence of a Salmonella Typhimurium OmpD mutant". INFECTION AND IMMUNITY ENE 1998, tomo 66, Nº 1, enero 1998 (1998-01) , páginas 387-390, XP002455109 ISSN: 0019-9567 describe mutantes de OmpD de Salmonella Typhimurium. Sin embargo, estos mutantes no son adecuados como vacuna bacteriana, ya que los mismos no se diferencian en su virulencia del tipo natural.

DORMAN C J ET AL: "CHARACTERIZATION OF... [Seguir leyendo]

1. Vacuna bacteriana para la aplicación en un animal, en particular un animal útil, que comprende al menos un serotipo del organismo Salmonella enterica con al menos respectivamente una mutación de desactivación en al

menos tres genes cromosómicos distintos, comprendiendo el al menos un serotipo Salmonella Typhimurium con al menos una mutación de desactivación en un gen que codifica la proteína OmpD.

2. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la al menos respectivamente una mutación de desactivación es una deleción no marcada. 10

3. Procedimiento para la producción de una vacuna de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que para la mutagénesis de OmpD en el serotipo Salmonella Typhimurium se usa un vector pROKB1 con un replicón R6K que contiene el gen OmpD con una mutación de desactivación.

4. Bacteria usada en una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2.

5. Vacuna viva de marcador negativo que comprende al menos una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2.

6. Vacuna inactivada de marcador negativo que comprende al menos una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Proteína inmunógena sintetizada por al menos un agente infeccioso bacteriano de un animal en una vacuna de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por que genera anticuerpos que preferentemente no son esenciales para una respuesta inmune protectora y donde interacciona con anticuerpos de al menos un suero de cerdos infectados por Salmonella Typhimurium y con anticuerpos de al menos un suero de cerdos vacunados con una vacuna frente a Salmonella Typhimurium, comprendiendo la proteína inmunógena la proteína OmpD de Salmonella Typhimurium.

8. Proteína inmunógena de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que está presente en forma de una proteína de fusión glutatión S-transferasa-OmpD.

9. Uso de una proteína inmunógena de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 u 8 para la detección de animales infectados de forma natural, de animales vacunados con una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2 y/o de animales infectados de forma natural y vacunados con una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2, en particular de cerdos.

10. Procedimiento de diagnóstico para la diferenciación de animales infectados, de animales vacunados con una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2 y/o de animales infectados de forma natural y vacunados con una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende la determinación serológica de proteínas inmunógenas no esenciales para la respuesta inmune protectora, en particular OmpD, en animales infectados de forma natural y/o en animales vacunados con una vacuna bacteriana de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 2.

11. Procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que se lleva a cabo en forma de un ensayo ELISA.

12. Placas de identificación, en particular placas de ELISA, con una proteína inmunógena de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 u 8. 50