Uso de fosfolipasas A2 secretadas en el diagnóstico y tratamiento de la malaria.

Un metodo de diagnostico in vitro de una infeccion por Plasmodium en un sujeto,

caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) medir la concentracion en el suero de al menos una fosfolipasa A2 secretada (sPLA2) seleccionada del grupo que consiste en sPLA2 GIIF, GV y GX, en dicho sujeto, en una muestra de sangre,

b) comparar la concentracion en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX obtenida en la etapa a) con la concentracion de referencia en suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en sujetos no infectados con Plasmodium respectivamente, en el que una concentracion superior en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en dicha muestra de sangre de dicho sujeto comparado con la concentracion de referencia en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en sujetos no infectados con Plasmodium, es indicativa de que dicho sujeto esta infectado con Plasmodium.

Uso de fosfolipasas A2 secretadas en el diagnóstico y tratamiento de la malaria.

La presente invención se refiere al uso de fosfolipasas kz secretadas en el diagnóstico y tratamiento de la malaria.

Los tejidos humanos secretan fosfolipasas A2 de bajo peso molecular (denominadas "PLA2 secretadas" o ',sPLA2"; EC 3.1.1.4) que catalizan la hidrólisis de fosfolípidos en la posición sn-2 para liberar ácidos grasos (tales como ácido araquidónico) y lisofosfolípidos. Los lisofosfol¡pidos son ácidos grasos que son biológicamente activos como 1 precursores de potentes mediadores lipidíeos bioactivos. Dichos mediadores lipidíeos son elementos importantes en la inflamación, cáncer y enfermedades neurodegenerativas (Kudo y Murakami 22; Nakanishi y Rosenberg, 26; Sun y col., 27). Además de la posible función de las sPLA2 humanas en la producción de mediadores lipidíeos, las pruebas acumuladas indican que es posible que estas enzimas participen en la inmunidad innata, en especial en la primera línea de defensa del hospedante contra bacterias y otros patógenos (Lambeau y Gelb, 28; Nevalainen y 15 col., 28). Las sPLA2 humanas comparten propiedades características comunes: numerosos enlaces disulfuro, masas moleculares bajas (13-18 kDa), restos de histidinilo y aspartilo catalíticos, y concentraciones milimolares de requisito de calcio para la actividad catalítica óptima. Sin embargo, los diferentes parálogos de sPLA2 humana no son isoformas estrechamente relacionadas puesto que la identidad de aminoácidos entre cualesquiera dos de estas está comprendida entre 15 % y 5 %. Además, los diferentes parálogos tienen propiedades enzimáticas muy 2 diferentes (Singer y col., 22) así como distinta distribución tisular, regulación de la expresión y funciones biológicas emergentes (Murakami y col., 21).

La familia de sPLA2 humanas comprende hasta ahora 9 enzimas catalíticamente activas y 2 proteínas de tipo sPLA2 catalíticamente inactivas (XIIB y otoconina-95). Se han clasificado como grupos (G) IB (Seilhamery col., 1986), IIA 25 (Kramer y col., 1989; Seilhamer y col., 1989), IID (Ishizaki y col., 1999), ME (Suzuki y col., 2), IIF (Valentín, 2b), III (Valentín, 2a), V (Chen y col., 1994), X (Cupillard y col., 1997) y XIIA (Gelb et al;, 2), XIIB (Rouault, M., y col., 23) y otoconina-95 (véanse también las revisiones de Schaloske y Dennis, 26; Lambeau y Gelb, 28 y Murakami y col., 21). La sPLA2 GIB (sPLA2 de tipo pancreático) y sPLA2 GIIA (sPLA2 de tipo inflamatorio) fueron las dos primeras sPLA2 humanas identificadas en los años 8 (Verheij y col., 1981 y Kramer et al;, 1989). Los 3 otros miembros de la familia de sPLA2 humanas se clonaron a finales de los 9 y más tarde (para una revisión véase Valentín y col., 2c y Murakami y col., 21).

Diferentes propiedades enzimáticas y distribución tisular y/o localizaciones celulares únicos de estas sPLA2 sugieren función o funciones fisiológicas distintas para cada enzima (para revisiones véase Lambeau y Gelb, 28 y 35 Murakami y col., 21). Algunas parece que tienen una función en diferentes enfermedades inflamatorias, tales como los grupos IIA y V (Gilroy y col., 24; Triggiani y col., 25) y algunas presentan propiedades bactericidas contra bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, tales como los grupos IIA, X, V, XII, ME, IB, IIF (Koduri y col., 22; Lambeau y Gelb, 28).

De hecho, las diferentes sPLA2 humanas ejercen funciones muy especializadas y no redundantes en diferentes tejidos y contextos biológicos (Murakami y col., 21). En efecto:

- las diferentes sPLA2 son expresadas en un número limitado de tejidos y células, se pueden encontrar en diferentes sitios en un solo tejido, y su expresión es regulada de modo diferencial de acuerdo con las etapas de la enfermedad

(Murakami y col., 21); p. ej., la detección de niveles altos de sPLA2 GIIA en diferentes sitios inflamados sugiere su implicación en la patogénesis de respuestas inflamatorias; su concentración en el suero y tejidos se correlaciona con la gravedad de la enfermedad en diferentes patologías inflamatorias inmunomediadas (Kudo y Murakami, 22; Nevalainen y col., 28; Menschikowski y col., 26);

- algunas sPLA2 tienen actividades enzimáticas altas y específicas frente a determinados fosfolípidos mientras que otras sPLA2 tienen actividades muy bajas frente a muchos sino todos los tipos de fosfolípidos (Singer y col., 22);

- unas pocas sPLA2 tienen capacidad para hidrolizar lipoproteínas y producir la liberación de mediadores lipidíeos de membranas celulares (Singer y col., 22 y Sato y col., 28);

- algunas sPLA2, sean muy o poco activas enzimáticamente, se pueden unir a diferentes proteínas unidas a membrana y solubles (Lambeau y col., 28);

- están surgiendo pruebas que indican que algunas sPLA2 ejercen funciones diferentes e incluso opuestas dentro

del mismo tejido in vivo; p. ej., tanto las sPLA2 GIIA como GV son proaterogénicas (Bostrom y col., 27; Webb y col., 23; Rosengren y col., 26 y Jonsson-Rylander y col., 28), mientras que las sPLA2 GX parece que son antiaterogénicas (Ait-Oufella y col., 29); además, la sPLA2 GIIA es proinflamatoria, mientras que la GV es antiinflamatoria en un modelo de ratón de artritis reumatoide (Boilard y col., 21);

- al contrario que la sPLA2 GIIA, parece que la sPLA2 GilD es anti-inflamatoria en modelos murinos de colitis y esclerosis múltiple (von Allmen y col., 29).

Parece a partir de lo anterior que las sPLA2 humanas actualmente se consideran isoformas funcionalmente distintas 1 con diferentes funciones biológicas y a veces opuestas.

En los seres humanos infectados por malaria, se han observado en casos graves niveles anormalmente elevados de actividad de fosfolipasa A2 en la circulación (Vadas y col., 1992 y 1993). De hecho, la actividad de fosfolipasa A2 observada por Vadas y col., se atribuye a la sPLA2 GIIA humana, puesto que los anticuerpos monoclonales murinos 15 9C1 y 4A1 usados por Vadas y col. (1992) son específicos para la sPLA2 GIIA, y el grupo de tipo sinovial II de PLA2 detectado por Vadas y col. (1993) se sabe que es la sPLA2 GIIA humana (véase Nevalainen y col., 25). Vadas y sus colaboradores también han descubierto que una PLA2 humana recombinante (de hecho sPLA2 GIIA) produce la lisis selectivamente de eritrocitos humanos parasitados con P. falciparum y sugieren que niveles altos en la circulación de PLA2 endógeno (es decir, sPLA2 GIIA) pueden contribuir a la hemolisis de eritrocitos parasitados en 2 pacientes con malaria (Vadas y col., 1992), pero no han proporcionado ningún dato que apoye estas afirmaciones.

Se refieren quinientos millones de casos clínicos de malaria cada año y se calcula que la mortalidad está en el intervalo entre ,7 y 2,7 millones. La amplia mayoría de los casos presenta una enfermedad febril no específica que se termina de forma relativamente fácil, pero una minoría de casos avanza a la enfermedad grave, potencialmente 25 mortal (WHO, Management of Severe Malaria, 2. A practical handbook, 2nd ed. Geneva: World Health Organisation). Ahora se acepta actualmente que la malaria grave es un trastorno de múltiples procesos y multisistémico extremadamente complejo. En los seres humanos la enfermedad es causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium: P. falciparum, P. malariae, P. ovale y P. vivax. El ciclo de vida de estos parásitos de malaria en seres humanos es esencialmente el mismo: primero los esporozoitos entran en el torrente 3 sanguíneo y migran al hígado. Después entran en las células hepáticas (hepatocitos), donde se multiplican en merozoitos, rompen las células hepáticas y vuelven a escapar al torrente sanguíneo. Después, los merozoitos entran en los glóbulos rojos (eritrocitos), donde se desarrollan en forma anillada, después en trofozoitos (una forma de alimentación), después esquizontes (una forma de reproducción) y de nuevo en merozoitos.

P. falciparum es la causa principal de mortalidad, principalmente a través de dos complicaciones principales: malaria cerebral y anemia grave. Una característica central de la infección por P. falciparum es el secuestro de formas maduras (esquizontes) de eritrocitos parasitados dentro de la microvasculatura de los órganos principales del cuerpo, predominantemente en el cerebro, corazón, pulmones e intestino delgado. Los sucesos que dan como resultado el desarrollo de malaria cerebral son multifactoriales, abarcando interacciones dinámicas entre al menos 4 tres procesos: secuestro de eritrocitos parasitados en el cerebro, hemostasia e inflamación (Van der Heyde, 26).

El diagnóstico de la malaria implica la identificación del parásito de la malaria o sus antígenos en la sangre del paciente. Se puede llevar a cabo por procedimientos de microscopía (p. ej., examen de... [Seguir leyendo]

1. Un método de diagnóstico in vitro de una infección por Plasmodium en un sujeto, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) medir la concentración en el suero de al menos una fosfolipasa A2 secretada (sPLA2) seleccionada del grupo que consiste en sPLA2 GIIF, GV y GX, en dicho sujeto, en una muestra de sangre,

b) comparar la concentración en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX obtenida en la etapa a) con la concentración de referencia en suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en sujetos no infectados con Plasmodium respectivamente, en el que una concentración superior en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en dicha muestra de sangre de dicho sujeto comparado con la concentración de referencia en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en sujetos no infectados con Plasmodium, es indicativa de que dicho sujeto está infectado con Plasmodium.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque además de la medición de la concentración en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX, también se mide la concentración en el suero de la sPLA2 GIIA, en el que una concentración superior en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX y sPLA2 GIIA en dicha muestra de sangre de dicho sujeto comparada con la concentración de referencia en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX y sPLA2 GIIA en sujetos no infectados con Plasmodium es indicativa de que dicho sujeto está infectado con Plasmodium.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque la medición de la concentración en el suero de las sPLA2 GIIA, GIIF, GV y/o GX, se lleva a cabo in vitro midiendo la actividad catalítica de dichas sPLA2 o por inmunoanálisis.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho sujeto es un ser humano y porque dicha concentración en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en dicha muestra de sangre, es respectivamente superior a 4, 11 y 2 pg/l, preferiblemente respectivamente superior a 8, 2 y 4 pg/l, medido con un inmunoanálisis adecuado.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho sujeto es un ser humano y porque dicha concentración en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GX en dicha muestra de sangre, es respectivamente superior a 4, 11 y 2 pg/l, y dicha concentración en el suero de GIIA en dicha muestra de sangre es superior a 1 pg/l, medido con un inmunoanálisis adecuado.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la infección por Plasmodium es una infección por P. falciparum.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 6, caracterizado porque se mide la concentración en el suero de las sPLA2 GIIF y GX, o sPLA2 GIIF, GV y GX.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se mide la concentración en el suero de las sPLA2 GIIF y/o GV, y opcionalmente además la sPLA2 GIIA, y porque una concentración superior en el suero de las sPLA2 GIIF y/o GV, y opcionalmente la sPLA2 GIIA, en dicha muestra de sangre de dicho sujeto comparada respectivamente con la concentración de referencia en el suero de las sPLA2 GIIF, GV y/o GIIA en sujetos no infectados con Plasmodium, es indicativa además de que dicho sujeto está infectado con Plasmodium con baja parasitemia.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 u 8, caracterizado porque dicha concentración superior en el suero de las sPLA2 GIIF y/o GV, y opcionalmente la sPLA2 GIIA, en dicha muestra de sangre de dicho sujeto es indicativa además de que dicho sujeto está en remisión.

1. Un kit para el diagnóstico de una infección por Plasmodium, preferiblemente una infección por P. falciparum, en un sujeto, que comprende:

- anticuerpos dirigidos contra una sPLA2 GilF de mamífero, anticuerpos dirigidos contra una sPLA2 GV de mamífero, y/o anticuerpos dirigidos contra una sPLA2 GX de mamífero,

- opcionalmente, anticuerpos dirigidos contra una sPLA2 GIIA de mamífero,

- al menos un suero de referencia o muestra de sangre de un mamífero infectado con Plasmodium, y

- al menos un suero o muestra de sangre de un mamífero no infectado con Plasmodium.

11. Uso de un anticuerpo dirigido contra una sPLA2 GilF, sPLA2 GV y/o sPLA2 GX de mamífero, y opcionalmente además un anticuerpo dirigido contra una sPLA2 GIIA de mamífero, para un diagnóstico in 1 vitro de una infección con Plasmodium en un sujeto.