Trampas de SUMO de alta afinidad.

Un polipéptido que comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM),

en el que dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de aminoácidos natural.

Trampas de SUMO de alta afinidad

Campo de la invención La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas diana basándose en su afinidad frente a reactivos de unión específicos. En particular, la invención se refiere a métodos para la purificación por afinidad de unión de SUMO (modificador pequeño de ubiquitina) y proteínas conjugadas con SUMO mediante el uso de proteínas de fusión que comprenden la organización en tándem de motivos de interacción con SUMO.

Antecedentes de la invención Las modificaciones post-traduccionales de proteínas con proteínas de la familia de la ubiquitina son procesos altamente dinámicos que aumentan el potencial de la célula de adaptarse a múltiples situaciones fisiológicas o patológicas (Hayashi et al., 2002; Seufert et al., 1995) . La modificación de proteínas por medio del modificador pequeño de ubiquitina (SUMO) da como resultado diversos desenlaces. Las primeras dianas de SUMO identificadas, la proteína oncogénica PML (leucemia promielocítica) y la proteína de transporte nucleocitoplasmático RanGAP1 (activadora de RanGTPasa1) , permitieron conectar las funciones de SUMO con la localización nuclear (Matunis et al., 1996; Lapenta et al., 1997; Mahajan et al. 1997; Wilkinson y Henley, 2010) . La identificación y caracterización de cientos de sustratos de SUMO sugiere el papel de SUMO como regulador de la actividad y estabilidad de las proteínas (Seeler y Dejean, 2003) . Las consecuencias corriente abajo están mediadas, al menos en parte, por efectores que contienen motivos de interacción con SUMO o SIM.

Las proteínas SUMO solamente tienen un 20 % de identidad con ubiquitina, sin embargo, tienen una estructura tridimensional similar (Kerscher et al., 2006) (Figura 1) . Tres formas de SUMO (SUMO-1, SUMO-2 y SUMO-3) se expresan de forma ubicua y migran con un peso molecular aparente de alrededor de 10 kDa en un gel desnaturalizante de poliacrilamida. SUMO-1 comparte solamente el 50 % de la identidad con SUMO-2 y SUMO-3, pero SUMO-2 y SUMO-3 son idénticas en el 97 %, y forman una subfamilia distinta conocida como SUMO 2/3 (Tatham et al., 2001) .

Como ocurre con la ubiquitina, las moléculas de SUMO se generan a través del procesamiento de un precursor de alto peso molecular, cuya escisión expone la firma de doble glicina que está involucrada en su conjugación a sustratos proteicos. Una cascada tiol-éster de 3 reacciones media la conjugación de las moléculas de SUMO (Figura 2) . Una única enzima activadora de SUMO (SAE) o E1, activa todas las moléculas de SUMO que se conjugan por E2 Ubc9 (Hay, 2005; Wilkinson y Henley, 2010) .

Este proceso está facilitado por una ligasa E3 específica de SUMO. Las ligasas de SUMO E3, tales como los miembros de la familia de PIAS (inhibidor de la proteína de STAT activado) y RanBP3 (proteína de unión a Ran 3) , contienen un motivo SP-RING (Nuevo Gen Realmente Interesante) que es esencial para su función (Kahyo et al., 2001 Schmidt y Muller, 2002) . Un grupo distinto de ligasas de SUMO está compuesto por la proteína Polycom (Pc2) que está asociada al silenciamiento génico (Kagey et al., 2003) . La SUMOilación es una modificación altamente reversible que está mediada por cisteína proteasas específicas de SUMO (SUSP o SEN) . En mamíferos se notificaron inicialmente 6 SENP, de las que SENP-1-SENP3 y SENP5-SENP7 son específicas para las proteínas 45 SUMO. La localización de los SENP y la especificidad para las isoformas de SUMO determina su acción (Yeh, 2009) . El mapeo inicial de la modificación en los restos de lisina de SUMO permitió la identificación de una secuencia consenso de SUMO compuesto por ψKxE, en el que ψ es un aminoácido hidrófobo grande y x cualquier aminoácido (Rodriguez et al., 2001; Xu et al., 2008) . Dicho consenso se descubrió en RanGAP1, PML, p53 y IκBα, entre otras proteínas e interacciona directamente con Ubc9 (Sampson et al., 2001; Wilkinson y Henley, 2010, ) . La lisina diana entra en el bolsillo catalítico de Ubc9 mientras que los restos hidrófobos y acídicos interaccionan con la superficie de esta E2 (Bernier-Villamor et al., 2002) . Sin embargo, no todos los sitios de SUMOilación se ajustan al consenso canónico, la modificación solamente ocurrirá si el consenso presenta una región desestructurada o una superficie de sustrato bien expuesta (Geiss-Friedlander y Melchior, 2007) .

La estimulación de las proteínas SUMO por sus sustratos podría alcanzarse mediante estrés celular, tales como el choque térmico. Golebiowski y colegas (Golebiowski, 2009) describieron un cambio cuantitativo en los perfiles globales de SUMOilación durante el choque térmico, debido a que los experimentos anteriores demostraron un aumento rápido y reversible de los conjugados de SUMO-2 y SUMO-3 cuando las células se desplazaron de la temperatura normal de crecimiento a 37 º C a la estresante de 43 º C (Saitoh y Hinchey, 2000) .

Las consecuencias de la SUMOilación de una nueva diana proteica son difíciles de predecir ya que los cambios de la conformación, creación o de enmascaramiento de las superficies de interacción pueden afectar a la actividad, estabilidad y localización de proteínas modificadas. Las proteínas SUMOiladas se reconocen por los motivos de interacción con SUMO (SIM) presentes en una gran diversidad de proteínas que incluyen la de leucemia 65 promielocítica (PML) , proteína asociada al dominio de muerte (Daxx) , enzima activadora de modificador similar a ubiquitina 2 (UBA2) , inhibidores de las proteínas de STAT activado (PIAS) y las ligasas de la proteína de los dedos

de RING 4 (RNF4) (Geiss Friedlander y Melchior 2007) . Los SIM contienen un núcleo hidrófobo flanqueado por restos acídicos (E/D) y uno de serina (Song et al., 2004; Hecker et al., 2006) . Los motivos SIM forman una lámina β que se une en orientación paralela o antipararalela entre la hélice α y una hebra β de SUMO (Figura 3) .

La afinidad de SIM y SUMO habitualmente es baja, alrededor del intervalo micromolar alto, lo que se debe normalmente a la superficie reducida de interacción. Para aumentar dicha afinidad, proteínas tales como la ligasa dependiente de SUMO RNF4 contiene 4 dominios SIM. Parece que SIM2 y SIM3 juegan un papel más importante en la captura de proteínas SUMOiladas (Tatham et al., 2008) . De este modo la PML SUMOilada se dirige a la degradación por el sistema ubiquitina-proteosoma, proporcionando la primera prueba molecular sobre cómo pueden contribuir las moléculas de SUMO a regular la estabilidad proteica. Se han publicado columnas de afinidad que contienen 4 SIM derivados del fragmento de origen natural 32-133 de RNF4 (Bruderer R et al. 2011) y que están comercializadas por BIOMOL (Affinity research) .

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención Basándose en la observación de que la proteína natural RNF4 (GeneBank ID: 6047) contiene más de un SIM, la presente invención genera proteínas con motivos de afinidad con SUMO adicionales. Estas proteínas manipuladas genéticamente deberían aumentar la afinidad de los SIM individuales para interaccionar con dianas de SUMO modificadas, permitiendo el estudio de los mecanismos de post-modificación que conectan las cascadas de señalización con funciones efectoras. De acuerdo con las estructuras moleculares descritas y publicadas para SUMO y los dominios SIM (Figura 3) , se esperaba una interacción cooperativa entre las moléculas de SUMO y estas trampas de SUMO diseñadas en la presente invención. Esta invención muestra los polipéptidos que se divulgan en la presente invención, de aquí en adelante citados como motivos de interacción con SUMO en tándem (TSIM) o entidades de unión a SUMO (SUBE) indistintamente, que expresan más de cuatro SIM organizados en tándem, preferentemente, al menos, ocho SIM organizados en tándem. Estos SIM en tándem se pueden usar eficazmente para capturar y analizar proteínas SUMOiladas in vitro y/o ex vivo. Además, los TSIM de la presente invención muestran una capacidad mayor para purificar proteínas SUMOiladas.

De acuerdo con la invención, la expresión "in vitro" se refiere a procesos biológicos o reacciones que se realizan usando componentes de un organismo que se han aislado de sus contextos biológicos habituales a fin de permitir un análisis más detallado o más conveniente que los que se pueden realizar con organismos completos, en un ambiente artificial, es decir un laboratorio.

De acuerdo con la invención, la expresión "ex vivo" se refiere a un proceso que tiene lugar fuera de un organismo. Particularmente, este término se refiere a la experimentación o mediciones hechas en o sobre una muestra o tejido en un ambiente artificial fuera del organismo con la... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM) , en el que dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de aminoácidos natural. 5

2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 en el que los motivos de interacción con SUMO se organizan en tándem y se eligen de los presentes en una proteína seleccionada de: PML, Daxx, UBA2, PIAS, ligasa RNF4 y/o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas.

3. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que los motivos de interacción con SUMO se seleccionan del grupo que comprende: SIM1, SIM2, SIM3, SIM4 y/o combinaciones de los mismos.

4. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipéptido comprende cuatro motivos SIM3 y cuatro SIM3 y/o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. 15

5. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 representado por SEC ID NO: 7.

6. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para el aislamiento in vitro y/o ex vivo

de proteínas SUMOiladas y/o para la identificación de los sustratos de SUMO. 20

7. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 7, representada por SEC ID NO: 6.

9. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Vector que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9. 30

11. Una célula que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9, o un vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un animal no humano que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 7 u 8, o una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9, o un vector de acuerdo con la reivindicación 10, o una célula de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Un proceso para obtener un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 5, que comprende cultivar

una célula de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones que permitan producir dicho polipéptido y, si se desea, 40 recuperar dicho polipéptido del medio de cultivo.

14. Un método in vitro para el aislamiento de una proteína SUMOilada de una muestra que comprende i) incubar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 con dicha muestra en 45 condiciones que permitan que dicho polipéptido interaccione con al menos una proteína SUMOilada presente en dicha muestra; y ii) recuperar cualquier proteína SUMOilada que se una a dicho polipéptido.

15. Un kit que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5. 50

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

Literatura no patente citada en la descripción