Selección de fármacos para la terapia del cáncer de pulmón utilizando matrices basadas en anticuerpos.

Un método para la selección de un fármaco anticáncer adecuado para el tratamiento de un tumor de pulmón,

que comprende:

(a) aislar las células del tumor de pulmón después de la administración de un medicamento contra el cáncer, o antes de la incubación con el fármaco contra el cáncer;

(b) lisar las células aisladas para producir un extracto celular;

(c) detectar un estado de activación de una pluralidad de moléculas de transducción de señales en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para una pluralidad de moléculas de transducción de señales, en el que los anticuerpos de captura están inmovilizados sobre un soporte sólido; y donde la pluralidad de moléculas de transducción de señales comprenden Her3(ErB3); y

(d) determinar si el fármaco anticáncer es adecuado o inadecuado para el tratamiento del tumor de pulmón mediante la comparación del estado de activación detectada por una pluralidad de moléculas de transducción de señales con un perfil de activación de referencia generado en ausencia del fármaco contra el cáncer.

Selección de fármacos para la terapia del cáncer de pulmón utilizando matrices basadas en anticuerpos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El proceso de transducción de señales en las células es responsable de una diversidad de funciones biológicas, entre ellas la división y muerte celular, el metabolismo, la activación de las células inmunológicas, la neurotransmisión y la percepción sensorial, entre otras muchas. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los trastornos en la transducción normal de señales en las células pueden conducir a varios estados patológicos, tales como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, la autoinmunidad y el cáncer.

Una ruta de transducción de señales bien caracterizada es la ruta de la MAP quinasa, que es responsable de la transducción de la señal del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de estimulación de la proliferación celular en las células (ver figura 1). El EGF se une a una tirosina quinasa unida a receptor transmembranal, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que resulta activado por la unión del EGF. La unión de EGF al EGFR activa la actividad de tirosina quinasa del dominio citoplasmático del receptor. Una consecuencia de esta activación de quinasa es la autofosforilación del EGFR en los residuos de tirosina. Los residuos de tirosina fosforilada en el EGFR activado proporcionan un sitio de anclaje para la unión de proteínas adaptadoras que contienen dominio SH2, tales como GRB2. En su función de adaptador, GRB2 se une además a un factor de intercambio de nucleótidos guanina, SOS, mediante un dominio SH3 en GRB2. La formación del complejo EGFR-GRB2-SOS conduce a la activación de SOS del factor de intercambio de nucleótidos de guanina, que estimula la eliminación de GDP de Ras. Tras la eliminación de GDP, Ras se une a GTP y resulta activado.

Tras la activación, Ras se une y activa la actividad de proteína quinasa de la RAF quinasa, una proteína quinasa específica de serina/treonina. A continuación se activa una cascada de proteínas quinasas que conduce a la proliferación celular. En líneas generales, la RAF quinasa fosforila y activa la MEK, otra serina/treonina quinasa. La MEK activada fosforila y activa la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). Entre las dianas para la fosforilación adicional por la MAPK se encuentran la proteína ribosómica 4S quinasa 6 (RSK). La fosforilación de la RSK por la MAPK resulta en la activación de RSK, que a su vez fosforila la proteína ribosómica S6. Otra diana conocida de la MAPK es el protooncogén c-Myc, un gen importante para la proliferación celular que se encuentra mutado en una diversidad de cánceres. MAPK también fosforila y activa otra proteína quinasa, MNK, que a su vez fosforila el factor de transcripción CREB. Indirectamente, MAPK regula además la transcripción del gen Fos, que codifica todavía otro factor de transcripción que participa en la proliferación celular. Mediante la alteración de los niveles y actividades de dichos factores de transcripción, MAPK transduce la señal extracelular originaria del EGF llevando a una transcripción alterada de genes que resultan importantes para la progresión del ciclo celular.

Dada la función crucial que desempeñan las rutas de transducción de señales en el crecimiento celular, no sorprende que muchos cánceres aparezcan como resultado de mutaciones y otras alteraciones en componentes de la transducción de señales que resultan en la activación aberrante de las rutas de proliferación celular. Por ejemplo, la sobreexpresión o hiperactividad de EGFR se ha asociado a varios cánceres, incluyendo el glioblastoma multiforme, el cáncer de colon y el cáncer de pulmón. Esto ha impulsado el desarrollo de terapéuticas anticáncer dirigidas contra EGFR, incluyendo el gefitiniby el erlotinib para el cáncer de pulmón, y el cetuximab para el cáncer de colon.

El cetuximab es un ejemplo de un inhibidor de anticuerpos monoclonales, el cual se une al dominio del EGFR de unión a ligandos extracelulares, impidiendo de esta manera la unión de ligandos que activan la EGFR tirosina quinasa. En contraste, el gefitinib y el erlotinib son moléculas pequeñas que inhiben la EGFR tirosina quinasa de localización intracelular. En ausencia de actividad de quinasa, el EGFR no puede autofosforilarse en los residuos de tirosina, lo que es un requisito previo para la unión de proteínas adaptadoras posteriores, tales como GRB2. Al detener la cascada de señalización en las células basadas en esta ruta para el crecimiento, se reducen la proliferación y migración tumoral.

Además, otros estudios han demostrado que aproximadamente 7% de los melanomas humanos y una fracción menor de otros tumores presentan una mutación puntual (V599E) en el gen Raf que conduce a la activación persistente de la ruta de MPAK (ver, por ejemplo, Davies et al., Nature 417:949-954, (22)). Estos resultados sugieren que las mutaciones, en particular en las rutas de transducción de señales, pueden ser características de tipos particulares de tumor y que dichas rutas específicas alteradas de transducción de señales podrían ser una diana prometedora para la intervención quimioterapéutica.

Las patentes WO 26/11998, WO 26/15642 y BARTLING B. ET AL.: "Comparative application of antibody and gene array for expression profiling in human squamous cell lung carcinoma", LUNG CANCER, vol.49, no. 2, Agosto 25, p.145-154.describe métodos relacionados con la selección de un fármaco apropiado para el cáncer de pulmón

y la correspondiente prognosis WO 2/9964, WO 26/55739 y ANGENENDT P ET AL: "3D Protein Microarrays: performing multiplex immunoassays on a single chip", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 75, no. 17, Septiembre 23, p.4368-4372 describe el uso de una pluralidad de diluciones seriadas de anticuerpos de captura.

J. A. Engelman ET AL: "ErbB-3 mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive non-small cell lung cáncer cell lines" Procedente de la Academia Nacional de Ciencias, vol.12, no.1, Marzo 25, p.3788-3793 trata sobre la expresión de ErbB3 en lineas celulares NSCLC sensibles a gefinitib.

Dado que diferentes tratamientos del cáncer, particularmente la quimioterapia del cáncer, pueden funcionar directa o indirectamente mediante el bloqueo o la activación de las rutas celulares de transducción de señales implicadas en la proliferación o muerte celular, respectivamente, la actividad de una ruta dada de transducción de señales en una forma particular de cáncer podría servir como un buen indicador de la eficacia de diversos tratamientos del cáncer. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, además de satisfacer otras necesidades, la presente invención proporciona un método para evaluar la efectividad de las potenciales terapias anticáncer en un paciente individual.

De esta manera, la presente invención proporciona métodos para ayudar al médico a seleccionar una terapia del cáncer adecuada, a la dosis correcta y en el momento correcto para cada paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para detectar los estados de activación de los componentes de las rutas de transducción de señales en las células tumorales de pulmón (por ejemplo células circulantes de un tumor de pulmón). La información sobre los estados de activación de los componentes de las rutas de transducción de señales derivadas de la práctica de la presente Invención puede utilizarse para el diagnóstico del cáncer, para el pronóstico y para el diseño de tratamientos del cáncer. La Invención está definida por las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1 muestra un ejemplo de una ruta de transducción de señales Implicada en la proliferación celular que puede utilizarse en la práctica de la Invención. Se ¡lustran componentes de la ruta EGFR/MAPK/ERK que es utilizada por las células para convertir una señal mitogénica en proliferación celular.

Figura 2 muestra esquemáticamente la aplicación de las matrices direccionables de la Invención para la selección de fármacos durante el curso del tratamiento del cáncer

Figura 3 muestra un ejemplo esquemático de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de una ruta de receptor de tirosina quinasa, tales como aquellos en la ruta EGFR/MAPK/ERK.

Figura 4 muestra un ejemplo esquemático de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de rutas de transducción de señales activadas en la angiogénesls tumoral.

Figura 5 A-B muestra una enumeración CTC usando el sistema Veridex CellSearch en un paciente 22 (A) y un paciente 215 (B).

DESCRIPCIÓN... [Seguir leyendo]

1. Un método para la selección de un fármaco anticáncer adecuado para el tratamiento de un tumor de pulmón, que comprende:

(a) aislar las células del tumor de pulmón después de la administración de un medicamento contra el cáncer, o antes de la Incubación con el fármaco contra el cáncer;

(b) Usar las células aisladas para producir un extracto celular;

(c) detectar un estado de activación de una pluralidad de moléculas de transducclón de señales en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para una pluralidad de moléculas de transducción de señales, en el que los anticuerpos de captura están Inmovilizados sobre un soporte sólido; y donde la pluralidad de moléculas de transducclón de señales comprenden Her3(ErB3); y

(d) determinar si el fármaco anticáncer es adecuado o Inadecuado para el tratamiento del tumor de pulmón mediante la comparación del estado de activación detectada por una pluralidad de moléculas de transducción de señales con un perfil de activación de referencia generado en ausencia del fármaco contra el cáncer.

2. Un método para la identificar la respuesta a un tratamiento de tumor de pulmón con un fármaco anticáncer, el método comprende:

(a) aislar las células del tumor de pulmón después de la administración de un medicamento contra el cáncer, o antes de la Incubación con el fármaco contra el cáncer;

(b) Usar las células aisladas para producir un extracto celular;

(c) detectar un estado de activación de una pluralidad de moléculas de transducclón de señales en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para una pluralidad de moléculas de transducclón de señales, en el que los anticuerpos de captura están inmovilizados sobre un soporte sólido; y donde la pluralidad de moléculas de transducclón de señales comprenden Her3(ErB3); y

(d) identificar si un tumor de pulmón responde o no responde al tratamiento con el fármaco anticáncer mediante la comparación del estado de activación detectado por una pluralidad de moléculas de transducción de señales con un perfil de activación de referencia generado en ausencia del fármaco contra el cáncer.

3. Un método para predecir la respuesta de un paciente que tiene un tumor de pulmón al tratamiento con un fármaco anticáncer, el método comprende:

(a) aislar las células del tumor de pulmón después de la administración de un medicamento contra el cáncer, o antes de la incubación con el fármaco contra el cáncer;

(b) lisar las células aisladas para producir un extracto celular;

(c) detectar un estado de activación de una pluralidad de moléculas de transducclón de señales en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para una pluralidad de moléculas de transducción de señales, en el que los anticuerpos de captura están Inmovilizados sobre un soporte sólido; y donde la pluralidad de moléculas de transducción de señales comprenden Her3(ErB3); y

(d) Predecir la probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el fármaco anticáncer mediante la comparación del estado de activación detectado por una pluralidad de moléculas de transducción de señales con un perfil de activación de referencia generado en ausencia del fármaco contra el cáncer.

4. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1, 2 ó 3, donde el tumor de pulmón se deriva de un sujeto con un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

5. El método de la reivindicación 4, en el que el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se selecciona del grupo que consiste en un carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes, carcinoma broncoalveolar (BAC), y carcinoma de células de avena.

6. El método de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en el que las células comprenden células circulantes del tumor de pulmón.

7. El método de la reivindicación 6, en el que las células circulantes son de un grupo que consiste en células tumorales circulantes, células endoteriales circulantes, células progenitoras endoteriales circulantes, células madre cancerosas, células tumorales diseminadas y las combinaciones de las mismas.

8. El método de la reivindicación 6 ó 7, en el que las células son aisladas de una muestra mediante separación inmunomagnética i la muestra se selecciona de un grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma, esputo, líquido de lavado bronquial, orina, aspirado de pezón, limfa, saliva, aspirado de aguja fina y las combinaciones de los mismos.

9. El método de las reivindicaciones 1,2 ó 3, en el que las células son aisladas a partir de tejido tumoral.

1. El método de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en el que el fármaco anticáncer comprende un agente que interfiere con la función de activación de los componentes de la ruta de transducción de señales en células cancerígenas.

11. El método de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en el que el paso (c) del ensayo comprende:

(i) Incubar el extracto celular con una pluralidad de diluciones seriadas de captura de anticuerpos para formar una pluralidad de analltos capturados.

(ii) Incubar la pluralidad de analltos capturados con anticuerpos específicos dependientes del estado de activación para los correspondientes analltos con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables.

(Ni) Incubar la pluralidad de analltos capturados detectables con un primer y segundo miembro de un par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y

(iv) Detectar la señal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de un par de amplificación de señales.

12. El método de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en el que el paso (c) del ensayo comprende:

(i) Incubar el extracto celular con una pluralidad de diluciones seriadas de captura de anticuerpos para formar una pluralidad de analitos capturados.

(ii) Incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activación y una pluralidad de anticuerpos específicos dependientes del estado de activación para los correspondientes analitos con el fin de formar una pluralidad de analltos capturados detectables, donde los anticuerpos independientes del estado de activación están etiquetados con una fracción facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activación están etiquetados con un primer miembro de un par de amplificación de señal, y la fracción facilitadora genera un agente oxidante el cual canaliza y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales;

(iii) incubar la pluralidad de analltos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y

(iv) Detectar la señal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de el par de amplificación de señales.

13. Usar una matriz que comprende una pluralidad de diluciones seriadas de anticuerpos de captura unidos a un soporte sólido, donde los anticuerpos de captura en cada dilución seriada son específicos para uno o más analitos correspondientes a una ruta de transducción de señal en un extracto celular, y donde los anticuerpos de captura comprenden anticuerpos reactivos con Her3 (ErbB3), para la selección de un fármaco anticáncer apropiado para el tratamiento de un tumor de pulmón, de acuerdo a el método de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3.

14. El uso de la reivindicación 13, donde la ruta de transducción de señal está Involucrada en la proliferación celular o la angiogénesis tumoral.

15. El uso de la reivindicación 13, donde el extracto celular comprende un extracto de células circulantes de un tumor sólido