Proteínas recombinantes de la seda de araña.

Una proteína recombinante de seda de araña que comprende una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas,

(a) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 5 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 o variantes de esta, o

(b) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 10 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o 10 variantes de esta y se combina con una unidad de repetición que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o variantes de esta,

en donde las variantes en cada caso tienen una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.

Proteínas recombinantes de la seda de araña La presente invención se dirige a proteínas recombinantes de la seda de araña, ácidos nucleicos, que codifican para estas proteínas recombinantes de la seda de araña, así como también huéspedes adecuados para la expresión de los ácidos nucleicos. Además, la presente invención se dirige a un método de agregación de proteínas de seda de araña y el uso de las proteínas en el campo de la biotecnología y/o medicina y otros campos industriales, en particular en la fabricación de piezas de automóviles, en la construcción de aviones, en el procesamiento de textiles y cuero, así como en la fabricación y

procesamiento de papel, cosméticos, alimentos, dispositivos electrónicos, administración de fármacos y similares.

En esta solicitud se usan las siguientes abreviaturas:

NR, no repetitivo; Apr, gen de resistencia a ampicilina; IPTG, isopropilo-Ã?-D-tiogalactosido; GdmCl, cloruro de guanidinio;

GdmSCN, tiocianato de guanidinio; SDS, dodecilsulfato de sodio; PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamina; Tris, tris (hidroximetil) aminometano; CD, dicroísmo circular; rep-proteínas, proteínas repetitivas; Da, Dalton; cps, cuentas por segundo; MRW, peso promedio por residuo; n.d., no determinado.

Las sedas de araña son polímeros de proteínas que muestran propiedades físicas extraordinarias (1) . Entre los diferentes tipos de sedas de araña, las draglines son las más intensamente estudiadas. Las sedas Dragline son utilizadas por las arañas que tejen orbe para construir el marco y los radios de las redes, como líneas de vida que se arrastran detrás de forma permanente. Para estos fines se requiere una alta resistencia a la tracción y elasticidad. La combinación de tales propiedades da como resultado una dureza que es mayor que la de la mayoría de otros materiales conocidos (1;2) . Las sedas Dragline se componen generalmente de dos proteínas principales cuyas estructuras primarias comparten una arquitectura común repetitiva (3;4) .

Las variaciones de una sola unidad de repetición, que puede comprender hasta 60 aminoácidos, son iterados varias veces para representar la parte más grande de una secuencia de seda dragline. Estas unidades de repetición comprenden un conjunto limitado de motivos de aminoácidos diferentes. Un motivo que se encuentra en las unidades de repetición de la seda dragline es un bloque típicamente de 6 -9 residuos de alanina. En los hilos de seda muchos motivos de poli-alanina forman pilas de láminas β cristalinas que conducen a resistencia a la tracción (5;6) .

Los motivos ricos en glicina tales como GGX o GPGXX adoptan estructuras helicoidales flexibles que conectan las regiones cristalinas y proporcionan elasticidad al hilo (7) .

Además, todas las proteínas de la seda dragline investigadas comprenden regiones en sus extremos carboxilo que no muestran ningún patrón de repetición obvio (regiones no repetitivas o NR) . Hasta el momento ninguna función podría asignarse a estas regiones en el hilo final.

El ensamblaje de la seda in vivo es un proceso notable. Las proteínas de la seda de araña dragline se almacenan en concentraciones de hasta 50 % (p/v) (8) en la denominada glándula ampulácea mayor. Aunque se ha propuesto una "estructura helicoidal suelta dinámica" para las proteínas dentro de la glándula ampulácea mayor (8) , datos más recientes sugieren una conformación aleatoria para las proteínas de la denominada Zona A, que representa la mayor parte de la glándula (9;10) . La solución proteica altamente concentrada forma la base de seda (solución de hilatura) , que muestra 45 propiedades de un cristal líquido (11-13) .

El ensamblaje del hilo se inicia durante un paso de la base a través del conducto de hilatura acompañado de extracción de agua, sodio y cloruro (14;15) . Al mismo tiempo las concentraciones de los iones más liotrópicos potasio y fosfato aumentan y el pH desciende de 6.9 a 6.3 (14-16) . Finalmente el ensamblaje se desencadena por tensión mecánica, que es causada al

tirar el hilo hacia fuera del abdomen de la araña (17) .

Para varios propósitos los hilos de seda natural no se pueden utilizar directamente, sino que tienen que ser disueltos y reagrupados en otras morfologías tales como películas, espumas, esferas, nanofibras, hidrogeles y similares.

La mayoría de las investigaciones relativas a películas fabricadas a partir de proteínas de la seda se han realizado con fibroína de seda, el componente proteico principal de la seda del gusano de la seda Bombyx mori. Las películas de fibroína de seda pueden moldearse a partir de soluciones acuosas o a partir de soluciones que contienen hexafluoroisopropanol (HFIP) , ácido fórmico, y ácido trifluoroacético. En solución, las fibroínas de seda tienden a adoptar conformaciones helicoidales o aleatorias, dependiendo del solvente usado. Cuando se moldea en películas, las proteínas mantienen la 60 conformación del estado soluble o adoptan una conformación más rica en lámina β. En la mayoría de los casos el

procesamiento de las películas con metanol conduce a un aumento adicional del contenido de láminas β y de la cristalinidad. Además de fibroína de seda, se han empleado además otras proteínas de la seda para moldear películas. Vollrath y colaboradores investigaron películas fabricadas de proteínas extraídas de la glándula ampulácea mayor de la araña Nephila senegalensis. Las películas moldeadas contenían principalmente proteínas en una conformación aleatoria cuando se prepararon a partir de una solución acuosa. Sus estructuras cambiaron a lámina β tras la adición de cloruro de potasio. Adicionalmente, se han fabricado películas a partir de una proteína de seda sintética derivada de la proteína de seda dragline MaSpl de la araña Nephila clavipes mediante el uso de HFIP como solvente. En solución la proteína adoptó una estructura de α-hélice que cambia a una conformación más rica en lámina β cuando se moldea en una película.

Desafortunadamente, la generación de materiales de película funcionales de fibroína de seda natural está restringida por su secuencia de aminoácidos. La modificación química selectiva de la fibroína de seda sólo es posible en una extensión muy limitada debido a la baja abundancia (<1.5%) de cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos que contienen grupos tiol, amino o carboxilo. Adicionalmente, la modificación genética dentro del huésped natural para alterar las proteínas de la seda y por lo tanto las propiedades de las películas es tedioso.

Aunque se han desentrañado algunos aspectos estructurales de las proteínas de la seda de araña, todavía se sabe poco sobre la contribución de las proteínas de seda individuales y sus elementos de estructura primaria para el proceso de ensamble. Los estudios comparativos de las dos principales proteínas de seda dragline de la araña de jardín Araneus diadematus, ADF-3 y ADF-4, revelaron que, aunque sus secuencia de aminoácidos son bastante similares (4) , ellas muestran características de solubilidad y de ensamblaje notablemente diferentes: Mientras ADF-3 es soluble incluso a altas concentraciones (18) , ADF-4 es virtualmente insoluble y se auto ensambla en estructuras filamentosas bajo condiciones especificas (resultados no publicados) .

El interés científico y comercial inició la investigación de la fabricación a escala industrial de la seda de araña. La producción de seda de araña nativa es poco práctica debido al canibalismo de las arañas, y la producción artificial ha encontrado problemas para lograr tanto un rendimiento suficiente de proteínas como un ensamblaje del hilo con calidad. La expresión bacteriana arrojó niveles de proteína bajas, probablemente causados por un uso de codones diferentes en bacterias y en arañas. Los genes sintéticos con un uso de codones adaptado para el huésped de expresión llevaron a rendimientos más altos, pero las proteínas sintetizadas de los mismos mostraron características diferentes en comparación con las sedas de araña nativas. La expresión de los ADNc de seda dragline parciales en líneas celulares de mamífero sí rindió proteínas de la seda (por ejemplo ADF-3) que podría hilarse artificialmente en hilos 'de seda', aunque todavía de calidad inferior.

WO03060099 se refiere a métodos y dispositivos para la hilatura de proteínas de biofilamentos en fibras. Esta invención es particularmente útil para la hilatura proteínas de seda recombinantes a partir de soluciones acuosas y mejorar la resistencia de las fibras y la viabilidad de fabricación para hacer que la producción comercial y el uso de tales fibras sea practicable. En... [Seguir leyendo]

1. Una proteína recombinante de seda de araña que comprende una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas,

(a) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 5 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 o variantes de esta, o

(b) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 10 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o variantes de esta y se combina con una unidad de repetición que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o variantes de esta,

en donde las variantes en cada caso tienen una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las 15 deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.

2. La proteína recombinante de seda de araña de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante de seda de araña comprende adicionalmente una o más secuencias de proteína de seda de araña repetitivas no auténticas, y en donde (i) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 14 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 10 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos,

(ii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 15 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 11 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos,

(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 32 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 31 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos, o (iv) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 34 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 33 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2

inserciones de aminoácidos.

3. La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia repetitiva sintética es (AQ) 12 o (AQ) 24, y en donde A representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 y Q representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4.

4. La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia repetitiva sintética es C16 o C32, y en donde C representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5.

5. La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las proteínas recombinantes de la seda de araña completas comprenden la fórmula (AQ) 12NR3, (AQ) 24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ) 12, (AQ) 24, C16 o C32, y en donde A representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3, Q representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4, C representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5, NR3 representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 10 y NR4 representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 11.

6. Una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. El vector de la reivindicación 7, que es un vector de clonación que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la sec. con núm. de ident.: 55.

9. El vector de la reivindicación 7, que comprende además una o más secuencias reguladoras, en donde el vector es un vector de expresión..

10. El vector de las reivindicaciones 7 a 9, que es un plásmido o un vector viral.

11. El vector de la reivindicación 10, en donde el vector es un sistema de baculovirus o un sistema de vector del virus 15 vaccinia.

12. Un huésped no humano, que ha sido transformado con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

13. El huésped de la reivindicación 12, que es una célula procariota preferentemente E. coli o Bacillus subtilis.

14. El huésped de la reivindicación 12, que es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, célula vegetal, célula de levadura o una célula de insecto.

15. El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula de mamífero es una célula CHO, COS, HeLa, 293T, HEH o

BHK, o en donde la célula de levadura se selecciona de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans, y Hansenula polymorpha.

16. El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula de insecto es seleccionada de células de insecto Lepidoptera, preferentemente de Spodoptera frugiperda y de Trichoplusia ni, preferentemente es una célula Sf9, Sf21 o high-5.

17. El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula vegetal se deriva de tabaco, papa, maíz, chícharo y tomate.

18. Un método de agregación de proteínas de seda de araña, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una solución de proteína que contiene proteínas de seda de araña no orientadas como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 5; b) exponer la solución preparada en a) a un inductor de de agregación; y c) recuperar las proteínas de seda de araña precipitadas.

19. El método de la reivindicación 18, en donde las proteínas de seda de araña usadas en la etapa a) se producen por transformación de un huésped adecuado de una o más de las reivindicaciones 12 a 17 con un vector de la reivindicación 7 a 11 o un ácido nucleico de la reivindicación 6, y expresar la proteína de seda de araña bajo condiciones adecuadas.

20. El método de las reivindicaciones 18 o 19, en donde el inductor de de agregación es seleccionado de acidificación, preferentemente a un pH de aproximadamente 1, fosfato de potasio y tensión mecánica, preferentemente al rotar la solución de proteína y aplicar fuerzas de cizalla y/o que comprende además la etapa de hilar dichas proteínas proporcionadas en la etapa a) o recuperadas en la etapa c) en filamentos, nanofibras e hilos por un método adecuado o formar una película.

21. Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones precedentes en el campo de la biotecnología o la medicina para la fabricación de sistemas de cierre o de cobertura de la herida, preferentemente para la fabricación de materiales de sutura, que están destinados con mayor preferencia para usar en neurocirugía

o cirugía oftálmica.

22. Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones precedentes para la fabricación de materiales de materiales de reemplazo, preferentemente materiales de cartílago o tendón artificiales.

23. Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de piezas de automóviles y aviones.

24. Sistemas de cierre o de cobertura de heridas, materiales de sutura, materiales de reemplazo, preferentemente

cartílago artificial, materiales de tendón, partes o piezas de automóviles usados en la construcción de aviones, que comprenden una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 o que se obtienen por un método de una o más de las reivindicaciones 18-20.

25. Un producto de papel, o un producto de textil o cuero, que comprende una proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.

26. El producto de textil o cuero de la reivindicación 25, en donde la proteína recombinante de seda de araña está presente como un recubrimiento.

27. Un gel o una espuma que comprende o que consiste en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el gel comprende o consiste preferentemente en proteínas basadas en (AQ) 12NR3, (AQ) 24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ) 12, (AQ) 24, C16 o C32.

28. Recubrimiento para los implantes y endoprótesis que comprenden o que consisten en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.

29. Una esfera, hilo o fibra, que comprende una proteína/hilo de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 y una fibra adicional, la fibra no es de origen de araña y preferentemente es una fibra derivada de planta o una fibra sintética.

30. Una película que comprende o que consiste en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 o que se basa en (AQ) 12NR3, (AQ) 24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ) 12, (AQ) 24, C16 o C32 y que comprende o consiste en preferentemente proteínas basadas en (AQ) 24NR3 o C16.

31. La película de la reivindicación 30, en donde la superficie de la película se modifica por las moléculas orgánicas pequeñas o macromoléculas biológicas, por ejemplo proteínas, fluoresceína o β-galactosidasa.