Producción de niveles altos de DHA en microalgas utilizando cantidades modificadas de cloruro y potasio.

Un método de producción de ácido docosahexaenoico (DHA) por cultivo de microalgas heterótrofas de la clase Dinofíceas en un medio de cultivo,

en donde el medio comprende:

(a) ión cloruro a una concentración menor que o igual a aproximadamente 2 g/l; y (b) ión potasio a una concentración mayor que o igual a aproximadamente 0,25 g/l;

en donde la microalga produce al menos aproximadamente 0,04 g DHA por 109 células.

Producción de niveles altos de DHA en microalgas utilizando cantidades modificadas de cloruro y potasio Campo de la Invención Esta invención se refiere en general a métodos para producción de ácidos grasos fuertemente insaturados por

microorganismos marinos utilizando cantidades modificadas de iones cloruro y potasio en el medio de cultivo. Más específicamente, la invención está dirigida a un proceso para producción de niveles altos de ácido docosahexaenoico (DHA) por cultivo de microalgas marinas que incluyen el dinoflagelado marino heterótrofo, Cr y pthecodinium, en fermentadores en condiciones no corrosivas, que incluye cultivo en un ambiente pobre en ion cloruro y rico en ion potasio. Se describen adicionalmente métodos para producción de ácidos grasos fuertemente insaturados, que incluyen DHA, por microorganismos marinos a niveles de pH bajos.

Antecedentes de la Invención Los efectos beneficiosos de la ingestión dietética incrementada de ácidos grasos omega-3 de cadena larga en humanos han sido bien documentados, lo que incluye la reducción de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias (a saber, artritis y ateroesclerosis) , reducción de la depresión, aumento de la duración de gestación en 15 el tercer trimestre, e inhibición del crecimiento de tumores. Se ha encontrado que varios microorganismos marinos heterótrofos producen niveles altos de estos ácidos grasos esenciales importantes, incluyendo el del género Cr y pthecodinium (Jiang y Chen, Process Biochemistr y 35 (2000) 1205-1209; Jiang y Chen, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, (1999) Vol. 23, 508-513; Vazhappilly y Chen, Journal of the American Oil Chemists Society, (1998) Vol. 75, No. 3 p 393-397; Kyle, Patente U.S. No. 5, 407, 957; Patente U.S. No.

5, 397, 591; Patente U.S. No. 5, 492, 938; y Patente U.S. No. 5, 711, 983) .

Cr y pthecodinium cohnii es uno de los organismos más deseables a utilizar para la producción de DHA (C22:6n-3) , uno de los ácidos grasos omega-3 de cadena larga más importantes. C. cohnii es ventajoso debido a que DHA es el único ácido graso poliinsaturado (PUFA) producido por este organismo en cantidades apreciables. Otros organismos producen dos o más ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) en sus lípidos, y la complejidad de su perfil lipídico 25 puede limitar el uso de sus aceites en algunas aplicaciones alimentarias y farmacéuticas (v.g. debido a la presencia de otros PUFAs indeseables en el aceite o debido a ratios de los diferentes PUFAs que caen fuera del intervalo deseable para la aplicación específica) . En el ambiente marino, Cr y pthecodinium cohnii se encuentra usualmente en agua de mar de salinidad alta, y como tal, está adaptado para crecimiento en un ambiente con una elevada concentración de cloruro. De hecho, la mayoría de los cultivos en la investigación publicada acerca de C. cohnii demuestran que el crecimiento y la producción de DHA se comporta óptimamente a salinidades mayores que aproximadamente 20% del agua de mar (Jiang y Chen) . La concentración de ion cloruro equivalente a 20% en agua de mar es aproximadamente 3870 ppm de ion cloruro o 3, 87 g/l de ion cloruro (Horne 1969) .

Tuttle y Loeblich (1975) desarrollaron un medio de crecimiento óptimo para C. cohnii. El medio descrito contenía una concentración de cloruro de sodio 342 milimolar (mM) . Los gramos por litro equivalentes de ion sodio e ion cloruro en una solución 342 mM de cloruro de sodio son 7, 86 g/l de ion sodio y 12, 12 g/l de ion cloruro.

Beasch & Holz (1973) informaron que cuando se cultivaba C. cohnii en un intervalo de concentraciones de NaCl (0, 3%, 1, 8% y 5, 0% (1, 82 g/l, 10, 9 g/l y 30, 3 g/l de ion cloruro, respectivamente) ) la producción de lípidos (expresada como mg por 109 células) disminuía a medida que descendían las concentraciones de NaCl. La producción de lípidos a 0, 3% NaCl era aproximadamente un tercio de la correspondiente a 5, 0% NaCl. Más recientemente, Jiang y

Chen (1999) determinaron los efectos de la salinidad sobre el crecimiento de las células y el contenido de DHA con 3 cepas de Cr y pthecodinium cohnii y encontraron en todos los casos que las tasas de crecimiento óptimas para las células y las producciones de DHA estaban comprendidas entre 5 g/l y 9 g/l de cloruro de sodio, lo que corresponde a 3, 0 y 5, 5 g/l de ion cloruro, respectivamente.

La concentración natural de cloruro en el agua del mar (19353 ppm, 0 19, 35 g/l de ion cloruro (Horne 1969, página 45 151) promueve corrosión en los fermentadores de acero inoxidable. Por ejemplo, de los dos grados comunes de acero inoxidable utilizados en la fabricación de fermentadores, el acero inoxidable 304 es susceptible de corrosión cuando el nivel de cloruro excede de 300 ppm (0, 3% g/l de ion cloruro) , y el acero inoxidable 316 es susceptible de corrosión cuando el nivel de cloruro excede de 1000 ppm (1 g/l de ion cloruro) . Existen otros grados de acero inoxidable que son más resistentes a la corrosión por el cloruro, pero los mismos son extremadamente caros y por

regla general se utilizan únicamente en equipos de fermentación empleados para la producción de compuestos muy costosos.

Aunque puede predecirse que la minimización de la corrosión de los fermentadores de acero inoxidable pueden conseguirse reduciendo las concentraciones de cloruro en el medio de cultivo, en la práctica esto no es una tarea fácil. Las microalgas marinas, que se derivan del mar, requieren generalmente cierta cantidad de ion cloruro,

preferiblemente como cloruro de sodio, para mantener el crecimiento y la producción de lípidos cuando crecen en cultivo.

Sin embargo, los intentos realizados hasta la fecha para cultivar microalgas marinas a concentraciones bajas de cloruro al tiempo que se mantienen los niveles de producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 tales como DHA han sido infructuosos. Jiang y Chen (1999) fueron incapaces de demostrar producciones significativas de DHA a niveles de NaCl inferiores a 5 g/l, correspondientes a un nivel de cloruro de aproximadamente 3033 ppm o 3 g/l.

La Patente U.S. No. 6.410.281, expedida el 25 de junio de 2002, otorgada a Barclay, proporciona un método para cultivar organismos eurihalinos tales como Thraustochytrium sp, y Schizochytrium sp. en medios pobres en cloruro por sustitución de sales de sodio distintas de cloruro a fin de reemplazar el sodio perdido cuando se reducen los niveles de cloruro de sodio.

Existe necesidad de un proceso que pueda permitir la producción de un alto producción de DHA a partir de Cr y pthecodinium cohnii, al tiempo que inhiba o evite la corrosión en los recipientes de producción más deseables comercialmente, fermentadores de cultivo de acero inoxidable. Este proceso debería hacer posible un crecimiento eficaz del microorganismo en un medio que contenga preferiblemente menos de 300 ppm de cloruro. Trescientas ppm de cloruro representan un nivel de 10 a 18 veces más bajo que los niveles mínimos de cloruro que, según demostraron Jiang y Chen (1999) , son los óptimos para la producción de cepas de Cr y pthecodinium.

Otra característica deseable de las fermentaciones microbianas es la capacidad para cultivar células a pH bajo (menor que o igual a aproximadamente pH = 5, 0) a fin de inhibir el crecimiento de bacterias en las fermentaciones fúngicas. Sin embargo, la literatura indica que Cr y pthecodinium cohnii se desarrolla óptimamente a un pH neutro (aproximadamente pH 7) . Tuttle y Loeblich en Phycologia vol. 14 (1) 1-8 (1975) exponen que el pH óptimo para crecimiento de Cr y pthecodinium es 6, 6, siendo el crecimiento "muy lento" por debajo de pH 5, 5. Existe necesidad de cepas y/o métodos de cultivo de Cr y pthecodinium a pH bajo al tiempo que retengan el crecimiento y la producción normales de DHA.

Sumario de la Invención Al intentar minimizar los niveles de cloruro de sodio en un medio de cultivo para Cr y pthecodinium, en el que el cloruro de sodio conduce al problema de corrosión de los fermentadores, los autores de la invención han descubierta sorprendentemente que los niveles de cloruro de sodio pueden reducirse por manipulación de las sales de sodio y preferiblemente de potasio en el medio de cultivo para compensar la disminución de ion cloruro (hasta 300 ppm o 0, 3 g/l de ion cloruro) al tiempo que se mantiene la producción de DHA similar al que se alcanza a aproximadamente 4, 5 g/l de NaCl (correspondiente a 2, 73 g/l de ion cloruro) .

Los autores de la presente invención han identificado condiciones de cultivo que hacen posible que Cr y pthecodinium

crezca en un medio con niveles de cloruro sustancialmente reducidos (hasta aproximadamente 0, 3 g/l de ion cloruro) sin afectar desfavorablemente al contenido de... [Seguir leyendo]

1. Un método de producción de ácido docosahexaenoico (DHA) por cultivo de microalgas heterótrofas de la clase Dinofíceas en un medio de cultivo, en donde el medio comprende:

(a) ión cloruro a una concentración menor que o igual a aproximadamente 2 g/l; y

(b) ión potasio a una concentración mayor que o igual a aproximadamente 0, 25 g/l; en donde la microalga produce al menos aproximadamente 0, 04 g DHA por 109 células.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el medio comprende además:

(c) ion sodio en una ratio menor que o igual a aproximadamente 27:1 peso:peso sodio:potasio.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la ratio sodio:potasio es menor que o igual a aproximadamente 10 15:1 peso:peso.

4. El método de la reivindicación 2, en donde la concentración de ion potasio es aproximadamente 0, 8 g/l y la ratio sodio:potasio es aproximadamente 4:1 peso:peso.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la microalga es del género Cr y pthecodinium.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la microalga es de la especie Cr y pthecodinium 15 cohnii.

7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion cloruro es menor que o igual a aproximadamente 1, 0 g/l.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion cloruro es menor que o igual a aproximadamente 0, 3 g/l.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion potasio es mayor que o igual a aproximadamente 0, 4 g/l.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion potasio es mayor que o igual a aproximadamente 0, 8 g/l.

11. El método de la reivindicación anterior, en donde una fuente del ion potasio es sulfato de potasio.

12. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el medio comprende adicionalmente ion sodio a una concentración que va desde aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 8 g/l.

13. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion sodio es de aproximadamente 1, 5 g/l a aproximadamente 5 g/l.

14. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde una fuente de ion sodio es sulfato de sodio.

15. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la concentración del ion potasio es aproximadamente 0, 8 g/l y la concentración del ion sodio es aproximadamente 3, 2 g/l.

16. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde las microalgas producen al menos aproximadamente 0, 10 g DHA por 109 células.

17. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde las microalgas producen al menos 35 aproximadamente 0, 20 g DHA por 109 células.

18. El método de cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente recuperar de las microalgas un lípido que contiene DHA