Producción de conjugados.

Un método para hacer reaccionar una primera entidad química, que es un anticuerpo,

y una segunda entidad química enzimática o ficobiliproteína fluorescente, para formar un conjugado en el que las entidades químicas primera y segunda están unidas covalentemente una con respecto a la otra, en el que la segunda entidad química comprende una pluralidad de grupos amina que se hacen reaccionar con un exceso de un reactivo heterobifuncional para generar una pluralidad de grupos reactivos con sulfhidrilo, comprendiendo el método poner en contacto simultáneo la primera entidad química, la segunda entidad química y un generador de tiol, en el que el generador de tiol reacciona con la primera entidad química en una reacción de tiolación que da como resultado la formación de un grupo sulfhidrilo libre en la primera entidad química, y el grupo sulfhidrilo libre reacciona con la segunda entidad química para formar el conjugado, y en el que la segunda entidad química es polivalente con respecto a su reactividad con los grupos sulfhidrilo, y en el que no hay separación o separación parcial de la primera entidad química tiolada del generador de tiol en exceso o de cualesquiera subproductos que se puedan formar antes de la puesta en contacto con la segunda entidad química.

Producción de conjugados Campo de la invención

Esta invención se refiere a la producción de conjugados, y se refiere a un método y a un kit para llevar a cabo el

método.

Antecedentes de la invención

Los conjugados se usan ampliamente en investigación biocientífica, en el diagnóstico y en medicina. En el caso más simple, los conjugados toman la forma de una primera entidad química (A), típicamente una molécula tal como una biomolécula, que está enlazada a una segunda entidad química (B), tal como una molécula marcadora, para formar un híbrido AB. También son posibles las formas oligoméricas, representadas por la fórmula A¡Bk, en la que j y k son números enteros. Los conjugados se diseñan habitualmente para un fin específico, y a menudo implican nuevas combinaciones de materiales que no son de origen natural. Típicamente, un componente del conjugado tiene la capacidad de interactuar con otras moléculas (por ejemplo antígenos), por ejemplo que es un anticuerpo, y el segundo componente añade alguna otra propiedad útil (por ejemplo capacidad de medición, capacidad para exterminar células cancerosas), por ejemplo que es un marcador.

Los conjugados pueden comprender combinaciones de entidades, en las que A y/o B pueden comprender uno de los siguientes: anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, perlas, polímeros, liposomas, hidratos de carbono, proteínas y colorantes fluorescentes, péptidos, radionúclidos, toxinas, partículas de oro, estreptavidina, biotina, enzimas, agentes quelantes, haptenos, fármacos, y muchas otras moléculas. La lista engloba un basto conjunto de moléculas, y de este modo el número de combinaciones posibles en los conjugados es casi ilimitado. Se concluye que hay un alcance considerable para crear nuevas moléculas híbridas con propiedades únicas o no habituales.

Una de las aplicaciones más importantes de los inmunoconjugados es la cuantificación y/o detección de antígenos, que a menudo se presentan en una superficie. Por ejemplo, en las aplicaciones de transferencia western, el antígeno se inmoviliza en una lámina de nitrocelulosa; en un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA), el antígeno se adsorbe sobre la superficie de una placa de poliestireno; en inmunohistoquímica, el antígeno está embebido, junto con muchas otras proteínas, en una rebanada delgada de tejido, que está unida a un portaobjetos de vidrio. Aunque estas técnicas difieren fundamentalmente en la forma en la que el antígeno es presentado al conjugado, la elección de los métodos de detección es esencialmente la misma. Hay dos tipos principales. Con la detección directa, el anticuerpo "primario" (es decir, el anticuerpo que se une al antígeno) se conjuga a un marcador que se puede medir con un dispositivo de medida adecuado. Con la detección indirecta, el marcador se introduce vía un segundo reactivo, que se une al anticuerpo primario. El reactivo secundario más a menudo es un conjugado de anticuerpo que comprende un anticuerpo secundario conjugado a un marcador. Existen más estrategias de detección complejas, pero cada una de estas generalmente es una variación de uno de los dos temas anteriores.

Con los métodos indirectos, un reactivo secundario se puede usar con un abanico de anticuerpos primarios no marcados, lo que es extremadamente conveniente, aunque la necesidad de más etapas de incubación y de lavado que con los métodos directos es una desventaja importante. Existe también el potencial de una reactividad cruzada indeseada del anticuerpo secundario con antígenos inmovilizados. Aunque los métodos de detección directos ofrecen ventajas considerables en términos de velocidad, coste, y calidad de datos, los métodos indirectos predominan actualmente. La explicación para este hecho es que la mayoría de los anticuerpos primarios están comercialmente disponibles sólo en una forma no marcada. Además, estos reactivos son caros y habitualmente no se pueden adquirir por investigadores en cantidades que permitan la producción, eficaz desde el punto de vista del coste, de conjugados marcados usando metodologías de mareaje actuales.

A fin de producir un conjugado, generalmente se usa un reactivo bifuncional, que contiene dos grupos reactivos, para enlazar los dos componentes de interés. Los grupos reactivos en el reactivo bifuncional son idénticos en funcionalidad ("homobifuncionales") o diferentes en funcionalidad ("heterobifuncionales"). El ejemplo mejor conocido de un reactivo homobifuncional es el bis-aldehído glutaraldehído, que reacciona con aminas (o hidrazidas). Puesto que la mayoría de las biomoléculas contienen múltiples aminas, el uso de glutaraldehído da como resultado habitualmente la formación de conjugados de peso molecular elevado. Además, la naturaleza polimérica de disoluciones de glutaraldehído, que puede variar considerablemente con la edad, significa que los conjugados preparados con glutaraldehído generalmente son bastante difíciles de reproducir.

Los reactivos heterobifuncionales generalmente se prefieren en la preparación de conjugados, puesto que permiten al operador ejercer un mayor grado de control sobre el proceso de conjugación. Una estrategia de conjugación heterobifuncional popular implica el acoplamiento de un grupo amino en una molécula (B) a un grupo sulfhidrilo libre (SH) en otra molécula (A) vía un reactivo heterobifuncional (X-Y) que tiene un resto reactivo con amina (X) y un resto reactivo con sulfhidrilo (Y). Un "espaciador" separa a menudo los restos reactivos del reactivo heterobifuncional; hay muchos reactivos heterobifuncionales que tienen estructuras espaciadoras variables, pero que comparten esencialmente la misma reactividad química.

Típicamente, una biomolécula (B) a conjugar se hace reaccionar, vía sus grupos amínicos, con la funcionalidad X del reactivo heterobifuncional, dando como resultado un derivado B-Y. El reactivo heterobifuncional en exceso se elimina entonces, y B-Y purificado se hace reaccionar con grupos sulfhidrilo en la otra molécula (A). X es habltualmente un áster de N-hidroxisuccInlmida (NHS), mientras que Y puede ser uno de varios restos. Y puede estar o no integrado en el conjugado AB final. El grupo sulfhidrilo derivado de A se incorpora casi siempre como un enlace de tloéter estable o como una mitad de un puente de disulfuro reversible (reducible) entre A y B. Y puede ser cualquier funcionalidad que reaccione con sulfhidrilo, Incluyendo: malelmlda, epóxldo, yodoacetllo, bromoacetilo, piridilditiol, metanotiosulfonato, y similares.

Los ejemplos de reactivos heterobifuncionales reactivos con amina y con sulfhidrilo Incluyen: 3-(2- plrldlldltlojpropionato de N-succinimidilo (SPDP); variantes de SPDP con espaciadores extendidos (LC-SPDP; LC = "cadena larga") y grupos sulfo para incrementar la solubilidad acuosa (sulfo-LC-SPDP); succinimldiloxicarbonil-a- met¡l-a-(2-plridilditio)tolueno (SMPT); sulfo-LC-SMPT; 4-(N-malelm¡domet¡l)c¡clohexano-1-carboxilato de succlnlmldllo (SMCC); sulfo-SMCC; éster de m-maleimidobenzoil-N-hldroxIsuccInlmida (MBS); sulfo-MBS; (4- yodoacetll)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB); sulfo-SlAB; 4-(p-malelmldofenil)butirato de succinimidilo (SMBP); sulfo-SMBP; éster de N-(Y-maleimidobutiriloxi)succln¡m¡da (GMBS); sulfo-GMBS; 6- ((yodoacetll)amino)hexanoato de succinimidilo (SIAX); y su forma de espaciador extendido SIAXX; 4- (((yodoacetll)amino)metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SIAC); y su forma de espaciador extendido (SIACX); yodoacetato de p-nitrofenilo (NPIA). Hay muchos otros ejemplos relacionados, tales como el enlazador reactivo con carbonilo y con sulfhidrilo, hidrazida del ácido p-maleimidopropiónico (BMPH).

Los grupos sulfhidrilo en A pueden ser nativos. Sin embargo, más habitualmente, los grupos sulfhidrilo no están presentes, y es necesario introducirlos mediante una reacción de tiolación antes de la etapa de conjugación. En el caso de anticuerpos, los grupos tiol se pueden generar por medio de un agente reductor (por ejemplo MEA o ditiotreitol (DTT)), que rompen los puentes de disulfuro en diversas posiciones en la molécula del anticuerpo. Como alternativa, se conocen técnicas mediante las cuales se pueden modificar otros grupos funcionales (habitualmente aminas) para introducir un grupo sulfhidrilo libre o un grupo sulfhidrilo protegido, que entonces se puede desproteger mediante tratamiento con un agente reductor para generar un producto tiolado (es decir, A-SH). En las técnicas convencionales conocidas, antes de la conjugación con B-Y, es necesaria al menos una etapa de separación para separar el producto tiolado deseado A-SH de un reactivo de tiolación sin reaccionar, y cualesquiera subproductos que incluyan grupos sulfhidrilo libre que competirían por la conjugación a B-Y, y... [Seguir leyendo]

1. Un método para hacer reaccionar una primera entidad química, que es un anticuerpo, y una segunda entidad química enzimática o ficobiliproteína fluorescente, para formar un conjugado en el que las entidades químicas primera y segunda están unidas covalentemente una con respecto a la otra, en el que la segunda entidad química comprende una pluralidad de grupos amina que se hacen reaccionar con un exceso de un reactivo heterobifuncional para generar una pluralidad de grupos reactivos con sulfhidrilo, comprendiendo el método poner en contacto simultáneo la primera entidad química, la segunda entidad química y un generador de tlol, en el que el generador de tiol reacciona con la primera entidad química en una reacción de tiolación que da como resultado la formación de un grupo sulfhidrilo libre en la primera entidad química, y el grupo sulfhidrilo libre reacciona con la segunda entidad química para formar el conjugado, y en el que la segunda entidad química es polivalente con respecto a su reactividad con los grupos sulfhidrilo, y en el que no hay separación o separación parcial de la primera entidad química tiolada del generador de tlol en exceso o de cualesquiera subproductos que se puedan formar antes de la puesta en contacto con la segunda entidad química.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el generador de tiol comprende 2-imlnotlolano.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la relación de segunda entidad química a generador de tlol está en el intervalo 1:1a 1:2.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que la relación está en el intervalo 1:1 a 1:15.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera entidad química, a segunda entidad química y el generador de tiol se combinan simultáneamente en un procedimiento de una etapa.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una primera etapa en la que se combinan el generador de tiol y la primera entidad química, y una segunda etapa en la que se combina la segunda entidad química con el generador de tiol y la primera entidad química.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una primera etapa en la que se combinan las entidades químicas primera y segunda, y una segunda etapa en la que se combina el generador de tiol con las entidades químicas primera y segunda.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una primera etapa en la que se combinan el generador de tiol y la segunda entidad química, y una segunda etapa en la que se combina la primera entidad química con el generador de tiol y la segunda entidad química.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que la primera entidad química se añade en forma líquida a una mezcla seca que comprende la segunda entidad química y el generador de tiol.

1. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además añadir un nucleófilo para terminar la reacción de conjugación.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda entidad química comprende una enzima.

12. Un kit de conjugación para uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una muestra liofilizada de la segunda entidad química y una muestra del generador de tiol según la reivindicación 1, e instrucciones para llevar a cabo el método de la reivindicación 1.

13. Un kit según la reivindicación 12, en el que al menos una muestra de generador de tiol se selecciona de una tiolactona, una iminotiolactona, un episulfuro y una tiazolidina.

14. Un kit según la reivindicación 12 ó 13, que comprende adicionalmente un poliol.

15. Un kit según la reivindicación 12, en el que el generador de tiol es 2-iminotiolano a un pH por debajo de 7,8.