Producción de ácido succínico en una célula eucariota.
Una célula eucariota recombinante seleccionada del grupo que consiste en una levadura y un hongo filamentoso que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico,
en la que la fumarato reductasa dependiente de NAD(H) es activa en el citosol con la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica fumarato reductasa dependiente de NAD(H).
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/065583.
Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..
Nacionalidad solicitante: Países Bajos.
Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.
Inventor/es: VERWAAL,René, WU,Liang, DAMVELD,Robbertus Antonius, SAGT,Cornelis Maria Jacobus.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/53 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
- C12P7/46 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Acidos dicarboxílicos con a lo más cuatro átomos de carbono, p. ej. ácido fumárico, ácido maleico.
PDF original: ES-2522622_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Producción de ácido succínico en una célula eucariota La presente invención se refiere a una célula eucariota recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarato reductasa, y a un procedimiento para la producción de ácido succínico en el que se usa la célula eucariota recombinante.
El ácido succínico es un precursor potencial para numerosas sustancias químicas. Por ejemplo, el ácido succínico 10 se puede convertir en 1, 4-butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado de ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara enlazando ácido succínico y BDO.
El ácido succínico se produce predominantemente a través de procedimientos petroquímicos mediante hidrogenación de butano. Se considera que estos procedimientos son perjudiciales para el medio ambiente, y son 15 costosos. La producción fermentativa de ácido succínico puede ser un procedimiento alternativo atractivo para la producción de ácido succínico, en el que se puede usar una materia prima renovable como fuente de carbono.
Se conoce que cierto número de diferentes bacterias, tales como Escherichia coli, y las bacterias de la panza Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia o Succinimonas sp. producen ácido succínico. La 20 ingeniería metabólica de estas cepas bacterianas ha mejorado el rendimiento y/o productividad de ácido succínico,
o ha reducido la formación de subproductos.
El documento EP1.672.077, por ejemplo, describe una Brevibacterium flavum genéticamente modificada con fumarato reductasa procedente de Escherichia coli, que incrementó el rendimiento de ácido succínico.
El documento WO 2007/061590 describe una levadura negativa a piruvato descarboxilasa para la producción de ácido málico y/o ácido succínico, la cual se transforma con una enzima piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una enzima malato deshidrogenasa, y una proteína transportadora de ácido málico (MAE) .
A pesar de las mejoras que se han realizado en la producción fermentativa de ácido succínico, sigue existiendo una necesidad de microorganismos mejorados para la producción fermentativa de ácido succínico.
El objetivo de la presente invención es un microorganismo alternativo para la producción de ácido succínico.
El objetivo se logra según la invención con una célula eucariota recombinante seleccionada del grupo que consiste en una levadura y un hongo filamentoso que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica fumarato reductasa dependiente de NAD (H) que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico.
Sorprendentemente, se encontró que una célula eucariota recombinante según la presente invención produce una cantidad incrementada de ácido succínico en comparación con la cantidad de ácido succínico producido por una célula eucariota de tipo salvaje. Preferiblemente, una célula eucariota según la presente invención produce al menos 1, 2, preferiblemente al menos 1, 5, preferiblemente al menos 2 veces más de ácido succínico que una célula eucariota de tipo salvaje que no comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la fumarato reductasa 45 dependiente de NAD (H) .
Como se usa aquí, una célula eucariota recombinante según la presente invención se define como una célula que contiene, o es transformada o modificada genéticamente con una secuencia de nucleótidos o polipéptido que no se produce de forma natural en la célula eucariota, o contiene una copia o copias adicionales de una secuencia de 50 ácido nucleico endógena. Una célula eucariota de tipo salvaje se define aquí como la célula progenitora de la célula recombinante.
La secuencia de nucleótidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico puede ser una secuencia de nucleótidos heteróloga u homóloga, o 55 codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) heteróloga u homóloga, que puede haber sido modificada genéticamente además por mutación, interrupción o supresión. Las técnicas de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica, tal como en Sambrook y Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laborator y Manual (3ª edición) , Cold Spring Harbor Laborator y Press”.
El término “homóloga”, cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido (recombinante) dada y un organismo hospedante o célula hospedante dado, se entiende que significa que en la
naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido se produce por una célula hospedante u organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa.
El término “heterólogo”, cuando se usa con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína, se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que está presente, o que se encuentra en una célula o lugar o lugares en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difieren de la que se encuentra en la naturaleza. Ã?cidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introducen, sino que se han obtenido a partir de otra célula o se han producido por vía sintética o recombinante.
Una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) según la presente invención usa NAD (H) como cofactor, mientras que la mayoría de las células eucariotas comprenden una fumarato reductasa dependiente de FADH2, en la que FADH2 es el cofactor. Se encontró ventajoso que la célula eucariota comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) , puesto que la fumarato reductasa dependiente de NAD (H) proporciona a la célula más opciones para oxidar NAD (H) a NAD+ e influir en el balance rédox en la célula.
Preferiblemente, la célula expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima y cataliza la formación de ácido succínico, en la que la secuencia de nucleótidos codifica preferiblemente una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) , que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40%, preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y/o SEC ID NO: 3, y/o SEC ID NO: 4, y/o SEC ID NO: 6. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y/o SEC ID NO: 3, y/o SEC ID NO: 4, y/o SEC ID NO: 6.
La identidad de secuencia se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (poliipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos) , según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las identidades o similitudes de secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” significa también el grado de relación de las secuencias entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determina mediante el apareamiento entre hebras de tales secuencias.
Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad, para dar el mayor apareamiento entre las secuencias ensayadas. Métodos para determinar la identidad y similitud son codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. Métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894) . Parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos usando BLASTP son abertura de salto 11, 0, extensión del salto 1, matriz Blosum 62.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas expresadas en la célula de la invención también se pueden definir por su capacidad de hibridarse con las secuencias de nucleótidos que codifican una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y/o SEC ID NO: 6, en condiciones de hibridación moderadas o, preferiblemente, en condiciones de hibridación rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos alrededor de 25, preferiblemente alrededor de 50 nucleótidos, 75 ó 100, y lo más preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 65º C en una disolución que comprende una sal de alrededor... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Una célula eucariota recombinante seleccionada del grupo que consiste en una levadura y un hongo filamentoso que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico, en la que la fumarato reductasa dependiente de NAD (H) es activa en el citosol con la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica fumarato reductasa dependiente de NAD (H) .
2. Una célula según la reivindicación 1, en la que la célula expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la formación de ácido succínico, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD (H) , que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3, y/o SEC ID NO: 6.
3. Una célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que la fumarato reductasa dependiente de NAD (H) deriva de una Tr y panosoma sp.
4. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la célula sobreexpresa además una secuencia de nucleótidos que codifica una piruvato carboxilasa.
5. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxicinasa heteróloga.
6. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa activa en el citosol con la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica malato deshidrogenasa.
7. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico en el citosol, con la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico.
8. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un transportador de ácido dicarboxílico.
9. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que al menos un gen que codifica alcohol deshidrogenasa es no funcional.
10. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que al menos un gen que codifica glicerol3-fosfato deshidrogenasa es no funcional.
11. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que al menos un gen que codifica succinato deshidrogenasa es no funcional.
12. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es una Aspergillus, preferiblemente una Aspergillus niger.
13. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es una Saccharomyces cerevisiae.
14. Un procedimiento para la preparación de ácido succínico, que comprende fermentar una célula eucariota según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un medio de fermentación adecuado, en el que se prepara ácido succínico.
15. Un caldo de fermentación que comprende ácido succínico, en el que el caldo de fermentación es obtenible mediante el procedimiento según la reivindicación 14.
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