Procedimiento microbiológico de síntesis de derivados de cinamoil-amidas de aminoácidos.

Procedimiento de preparacion de moleculas que tienen la siguiente formula (I):

**fórmula**

en la que:

A es un grupo seleccionado de -CH≥CH- y -CH2-CH2-,

x1 es un numero entero seleccionado de 0 y 1,

x2 es un numero entero seleccionado de 0 y 1,

R1, R2, independientemente entre si, son un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y grupos -CO-R4 y R4 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo y bencilo,

R3 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y una cadena peptidica de aminoacidos que comprende de 1 a 30 aminoacidos,

* es la configuracion optica L o D del aminoacido -NH-CHR-COO-, * puede representar una u otra de las configuraciones segun la eleccion de R,

R es una cadena lateral de aminoacido seleccionada de entre: -H (glicina), -CH3 (L-alanina, D-alanina), -CH2OH (Lserina), -CHOH-CH3 (L-treonina), -CH2OR5 (L-serina con su grupo funcional hidroxilo protegido), -CHOR5-CH3 (L20 treonina con su grupo funcional hidroxilo protegido), y R5 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y grupos -CO-R6, y R6 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo y bencilo,

Procedimiento microbiológico de síntesis de derivados de cinamoil-amidas de aminoácidos La invención tiene por objeto un procedimiento de producción microbiológico de derivados de cinamoil-amidas de aminoácidos, determinados productos que resultan y su uso, en particular como antioxidantes.

Se han aislado moléculas de esta familia esencialmente del reino vegetal, principalmente de los órganos reproductores de plantas, mientras que parecen estar ausentes de las partes verdes de estas (Martin-Tanguy y col., 10 Phytochemistr y , 17: 1927-1928, 1978; FEBS Lett., 108: 176-178, 1979) . En 2003, Alemano y col. (Annals of Botany,

92: 613-623) identificaron la N-cafeoil-tirosina y la N-cafeoil-DOPA en células de embriogénesis somática de Theobroma cacao. Más tarde, se pusieron de manifiesto en los granos de café verde (robusta) la p-cumaroil-Ntirosina, feruloil-N-tirosina, feruloil-N-triptófano y cafeoil-N-fenilalanina (Clifford and Knight, Food chemistr y , 87: 457453, 2003) , si bien previamente se había constatado ya su poder antioxidante (Sanbongi y col., J. Agric. Food Chem.

46: 454-457, 1998) . Además, Stark et Hoffman (J. Agric. Food Chem., 53: 5419-5428, 2005) y además Stark y col.

(J. Agric. Food Chem., 54: 2859-2867, 2006) después identificaron y completaron la lista mediante otros análogos presentes en las mismas fuentes vegetales.

Las amidas de ácidos cinámico e hidroxicinámico se han identificado y evaluado sobre todo por sus actividades 20 antioxidantes importantes (Spasova y col., J. Peptide Sci., 12: 369-375, 2006) , propiedad que parece inherente a todas las estructuras de este tipo.

Se han citado otras moléculas como la amida 4-hidroxicinamoil- (éster de metilo de L-fenilalanina) o también la amida 3, 4-dihidroxicinamoil- (éster de dibencilo del ácido L-aspártico) , por su actividad antioxidante contra la 25 oxidación de las LDL (lipoproteínas de baja densidad) por el cobre, y estas moléculas inhiben al mismo tiempo la actividad de la acil-CoA:colesterol aciltransferasa humana (Lee y col., Biorg. Med. Chem. Letters, 14: 4677-4681, 2004) ; por lo tanto están implicadas en la hipercolesterolemia. Las N-cinamoil-amidas también se han descrito como que son agentes de antiagregación de plaquetas (Hung y col., Bioorganic and Medicinal Chemistr y , 13: 1791-1797, 2005) . Las clovamidas (N-cinamoil-tirosina) que son fitoalexinas se acumulan en las plantas después del ataque de patógenos (Yamamoto y col., Pharmacol. Biochem. Behav., 40: 465-469, 1991) también forman parte, y como tales son conocidas por ser potentes antimicrobianos.

Por último, también se han descrito recientemente actividades vasorrelajantes de derivados de ácidos Ncafeoilamino-R (R = GABA o ácido hexanoico) (Iizuka y col., Yakugaku Zasshi, 123: 963-971, 2003) .

Los derivados de cinamoilamida de aminoácidos constituyen, por lo tanto, una familia de moléculas con un potencial importante tanto en el campo terapéutico como en el cosmético, o también como agente conservante. Sin embargo, su aislamiento a partir de plantas es difícil, los rendimientos y las cantidades son pequeñas y las estructuras poco diversificadas.

Se han descrito procedimientos para la síntesis de algunas de estas moléculas por vía química; pero requieren varias etapas, usan compuestos tóxicos y por consiguiente son difíciles de industrializar:

En la síntesis descrita por Iizuka y col. (Yakugaku Zasshi, 123: 963-971, 2003) , son necesarias 4 etapas: (1)

protección de los grupos funcionales hidroxilo del ciclo mediante cloroacetato de etilo en medio básico, (2) después acoplamiento mediante la diciclohexilcarbodiimida (DCCDI) ; (3) después el aminoácido se acopla en presencia de trietilamina, y finalmente (4) una hidrólisis libera los grupos funcionales hidroxilo del núcleo aromático (desprotección) . Por este procedimiento se han sintetizado la N-cafeoilglicina, N-cinamoilglicina, N-cafeoil-º-alanina, N-cinamoil-º-alanina.

Otra síntesis más rápida se basa en la fijación del aminoácido (ácido L-aspártico o L-triptófano en este caso) en el cloruro de acilo correspondiente después de la protección previa de los grupos hidroxilo del ciclo aromático por la dimetilaminopiridina (DMAP) . La reacción de amidación se lleva a cabo por reflujo en presencia de tetrahidrofurano (THF) , seguido finalmente de una desprotección para liberar los hidroxilos (Stark et Hofmann, J. Agric. Food Chem.,

53: 5419-5428, 2005; Stark y col., J. Agric. Food Chem., 54: 2859-2867, 2006) .

Se citan también los trabajos de Tada y col. (J. Oleo Sci., 51: 19-27, 2002) que describen la síntesis de diferentes derivados, de los cuales el éster metílico de la N-cafeoil-O-acetilserina tiene una fuerte actividad antioxidante e inhibidora de la tirosinasa. Por otra parte, Lee y col. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 14: 4677-4681, 2004) han llevado a cabo la síntesis de ésteres de p-cumaroilamida del ácido aspártico (éster metílico) y de la fenilalanina (éster dibencílico) respectivamente, por un procedimiento equivalente al de Iizuka y col. (Yakugaku Zasshi, 123: 963-971, 2003) (ver más arriba) .

También se ha descrito una síntesis que usa una arilasa de Streptomyces mobaraensisa en la solicitud JP 2006067870 A.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento sencillo, fácil de aplicar, industrializable, y que permita la preparación de derivados de cinamoil-amida de aminoácidos. La invención tiene como primer objeto un 10 procedimiento de preparación de moléculas que responden a la siguiente fórmula (I) :

en la que:

A representa un grupo seleccionado de -CH=CH- y -CH2-CH2-, x1 es un número entero seleccionado de 0 y 1, x2 es un número entero seleccionado de 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, representan un grupo seleccionado de: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R4, R4 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, R3 representa un grupo seleccionado de: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

* representa la configuración óptica L o D del aminoácido -NH-CHR-COO-, * puede representar una u otra de las configuraciones según la elección de R,

R representa una cadena lateral de aminoácido seleccionada de: -H (glicina) , -CH3 (L-alanina, D-alanina) , -CH2OH (L-serina) , -CHOH-CH3 (L-treonina) , -CH2OR5 (L-serina con su grupo funcional hidroxilo protegido) , -CHOR5-CH3 (Ltreonina con su grupo funcional hidroxilo protegido) , R5 representa un grupo seleccionado de: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R6, R6 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo.

Por alquilo C1-C6 se entiende un grupo alquilo, lineal, ramificado o cíclico, que comprende de 1 a 6 átomos de carbono, como por ejemplo un grupo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, n-pentilo, n-hexilo.

De acuerdo con la invención, las moléculas de fórmula (I) se preparan por un procedimiento que consta de al menos una etapa de cultivo de al menos una bacteria seleccionada de las Bacillaceae, en presencia de al menos dos 35 sustratos seleccionados de los de las siguientes fórmulas (II) y (III) :

en las que A, x1, x2; R3, * y R tienen la misma definición que en la fórmula (I) . R1, R2, independientemente entre sí representan un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos 5 -CO-R4, R4 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo.

Por alquilo C1-C6 se entiende un grupo alquilo, lineal, ramificado o cíclico, que comprende de 1 a 6 átomos de carbono, como por ejemplo un grupo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, n-pentilo, n-hexilo.

Preferiblemente, el procedimiento de la invención consta de una etapa de cultivo de al menos una bacteria seleccionada de las que pertenecen al género Bacillus, todavía más preferiblemente una bacteria seleccionada de: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus (o Geobacillus) stearothermophilus, Bacillus caldotenax.

Y preferiblemente la bacteria se selecciona de:

• Bacillus subtilis subsp. Spizizenii: DSM 15029 (temperatura de crecimiento = 30°C)

• Bacillus licheniformis: DSM 13, ATCC 14580, NCIB - 9375 (temperatura de crecimiento = 30°C)

• Bacillus thermoamylovorans (cepa aislada por el laboratorio IRD-Marseille) : DSM 13307 (temperatura de 20 crecimiento = 50°C)

• Bacillus (o Geobacillus) stearothermophilus: DSM 22, ATCC 12980, NCIB 8923 (temperatura de crecimiento = 55°C)

• Bacillus caldotenax: DSM 406 (temperatura de crecimiento... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de moléculas que tienen la siguiente fórmula (I) :

en la que:

A es un grupo seleccionado de -CH=CH- y -CH2-CH2-,

x1 es un número entero seleccionado de 0 y 1, x2 es un número entero seleccionado de 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y grupos -CO-R4 y R4 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo y bencilo, R3 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

* es la configuración óptica L o D del aminoácido -NH-CHR-COO-, * puede representar una u otra de las configuraciones según la elección de R, R es una cadena lateral de aminoácido seleccionada de entre: -H (glicina) , -CH3 (L-alanina, D-alanina) , -CH2OH (Lserina) , -CHOH-CH3 (L-treonina) , -CH2OR5 (L-serina con su grupo funcional hidroxilo protegido) , -CHOR5-CH3 (L

treonina con su grupo funcional hidroxilo protegido) , y R5 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, y grupos -CO-R6, y R6 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo y bencilo,

comprendiendo dicho procedimiento al menos una etapa de cultivo de al menos una bacteria seleccionada de las Bacillaceae, en presencia de al menos dos sustratos seleccionados de los que tienen las siguientes fórmulas (II) y 25 (III) :

en las que A, x1, x2; R3, * y R tienen la misma definición que en la fórmula (I) , R1, R2, independientemente entre sí son un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo y grupos -CO-R4 y R4 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la bacteria se elige de las que pertenecen al género Bacillus y preferiblemente de entre: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus (o Geobacillus) stearothermophilus, Bacillus caldotenax.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la bacteria se selecciona de entre: 10

- Bacillus subtilis subsp. Spizizenii: DSM 15029

- Bacillus licheniformis: DSM 13, ATCC 14580, NCIB - 9375

- Bacillus thermoamylovorans DSM 13307

-Bacillus (o Geobacillus) stearothermophilus: DSM 22, ATCC 12980, NCIB 892.

15. Bacillus caldotenax: DSM 406

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la fórmula (I) se cumplen una o más de las siguientes condiciones:

A es un grupo -CH=CH-, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de entre: H y un grupo metilo, R3 es H, R es una cadena lateral de aminoácido seleccionada de entre: -H (glicina) , -CH3 (L-alanina, D-alanina) , -CH2OH (Lserina) , -CHOH-CH3 (L-treonina) .

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cultivo de la bacteria se hace en un medio que comprende sales minerales y un extracto de levadura.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cultivo de la

bacteria se hace en un medio que comprende, además del o de los aminoácidos de fórmula (III) , al menos otro aminoácido seleccionado de entre: lisina, prolina, cisteína.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el precursor (II)

se introduce en el medio de cultivo en forma de un extracto vegetal. 35

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende preferiblemente las siguientes etapas:

- centrifugación.

40. recuperación del sobrenadante,

- purificación del producto (I) .

9. Uso del procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para preparar una molécula seleccionada de entre: 45

- N-cinamoil-glicina,

- N-cinamoil-L-alanina,

- N-cinamoil-D-alanina,

- N-cinamoil-L-serina, .

50. N-cinamoil-L-treonina,

- N- (4-metoxicinamoil) -glicina,

- N- (4-metoxicinamoil) -L-alanina,

- N- (4-metoxicinamoil) -D-alanina,

- N- (4-metoxicinamoil) -L-serina, .

55. N- (4-metoxicinamoil) -L-treonina

- N- (3, 4-dimetoxicinamoil) -glicina,

- N- (3, 4-dimetoxicinamoil) -L-alanina,

- N- (3, 4-dimetoxicinamoil) -D-alanina,

- N- (3, 4-dimetoxicinamoil) -L-serina,

- N- (3, 4-dimetoxicinamoil) -L-treonina,

- N-cumaroil-L-treonina,

- N-cafeoil-L-treonina,

- N-cumaroil-L-serina 5 - N-cafeoil-L-serina

- N-cumaroil-L-alanina,

- N-cafeoil-L-alanina,

- N-cumaroil-D-alanina,

- N-cafeoil-D-alanina, .

10. N-cumaroil-glicina,

- N-cafeoil-glicina.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar un compuesto que tiene la siguiente fórmula (Ia) : 15

en la que:

A es un grupo seleccionado de entre -CH=CH- y -CH2-CH2-, x1 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, x2 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R4 y R4 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo,

R3 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

* es la configuración óptica L, R5 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R6 y R6 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar un compuesto que tiene la siguiente fórmula (Ib) :

en la que:

A es un grupo seleccionado de entre -CH=CH- y -CH2-CH2-, x1 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, x2 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R4, y R4 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo,

R3 representa un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

* es la configuración óptica L, R5 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R6 y R6 es un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo,

excluyendo los siguientes compuestos donde:

A es CH=CH-, x1 = 1, x2 = 1, y

- R1 = R2 = CH3CO-, R3 = CH3, R5 = CH3CO-, o

-R1 = R2 = CH3CO-, R3= H, R5 = H, o

-R1 = R2 = CH3CO-, R3 = tBu, R5 = tBu.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar un compuesto 25 que tiene la siguiente fórmula (Ic) : en la que:

A es un grupo seleccionado de entre -CH=CH- y -CH2-CH2-, x1 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1,

x2 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de entre: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R4, y R4 representa un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, R3 es un grupo seleccionado de entre: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

* es la configuración óptica L o D,

excluyendo los casos donde:

*es la configuración óptica L y 15 A es -CH=CH-, y

-x1 = x2 = 0, R3 = tBu.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar un compuesto 20 que tiene la siguiente fórmula (Id) :

en la que:

A es un grupo seleccionado de entre -CH=CH- y -CH2-CH2-, x1 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, x2 es un número entero seleccionado de entre 0 y 1, R1, R2, independientemente entre sí, son un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, grupos -CO-R4 y

R4 es un grupo seleccionado de: alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, R3 es un grupo seleccionado de: H, alquilos C1-C6, fenilo, bencilo, una cadena peptídica de aminoácidos que comprende de 1 a 30 aminoácidos,

excluyendo los casos donde: 35 A representa -CH=CH- y:

-x1 = x2 = 0, R1 = CH3, R3 =H

-x1 = 1, x2 = 0, R1 = CH3, R3 = C2H.

40. x1 = x2 = 0, R3 =H.