Procedimiento insensible a heparina para la determinación de inhibidores directos del factor de coagulación.

Procedimiento para la determinación de un inhibidor directo de un factor de coagulación en una muestra,

siendo seleccionado el inhibidor directo del factor de coagulación a partir del grupo de inhibidores directos de trombina hirudina, dabigatran, melagatran, argatroban, ximelagatran, bivalirudin, lepirudin, MCC-977,SSR-182289, TGN-255, TGN-167, ARC-183 y odiparcil, o a partir del grupo de inhibidores directos del factor Xa rivaroxaban, apixaban, o tamixaban, LY 517717, YM 153, DU-176b, DX-9065a y KFA-19982, presentando el procedimiento los siguientes pasos en el orden citado:

a) mezclado de la muestra con un agente oxidante para dar una carga de reacción;

b) incubación de la carga de reacción;

c) mezclado de la carga de reacción con un agente que neutraliza el agente oxidante;

d) adición de una cantidad definida de factor de coagulación activado trombina o factor Xa a la carga de reacción;

e) determinación de la inhibición del factor de coagulación activado añadido.

Procedimiento insensible a heparina para la determinación de inhibidores directos del factor de coagulación

La presente invención se sitúa en el campo del diagnóstico de coagulación, y se refiere a un procedimiento insensible a heparina para la determinación de inhibidores directos del factor de coagulación en una muestra, en especial de inhibidores directos de trombina y factor Xa, así como a un kit de ensayo para el empleo en tal procedimiento.

En la terapia anticoagulación se emplean en medida creciente nuevos inhibidores de coagulación directos, en especial inhibidores directos de trombina (factor lia) y factor Xa. Estos nuevos inhibidores de coagulación tienen el potencial para eliminar los inhibidores indirectos de coagulación empleados hasta la fecha, sobre todo heparina y sus derivados, que desarrollan su acción inhibidora de coagulación sólo en cooperación con factores como el cofactor II antitrombina o heparina. No obstante, actualmente se emplean particularmente las diferentes heparinas.

La acción inhibidora de coagulación de todas las heparinas se basa en su formación de complejos con antitrombina (AT, antitrombina III), el más importante inhibidor plasmático de factores de coagulación activados. La antitrombina pertenece al grupo de inhibidores de serinproteasas (serpinas), e inhibe factores de coagulación trombina (factor lia, Fila) y factor Xa (FXa), así como, en medida reducida, también las demás serinproteasas FlXa, FXIa, FXIIa, calicreína y plasmina. Mediante la unión de heparina a antitrombina se llega a un cambio de conformación de la antitrombina, que refuerza la acción inhibidora de antitrombina en un múltiplo. El punto de unión en moléculas de heparina, que es responsable de la unión a antitrombina, está constituido por una secuencia de pentasacáridos característica. Una forma completamente sintética de este pentasacárido (fondaparinux) se emplea, al igual que UFH o LMWH, para la inhibición medicamentosa de la capacidad de coagulación.

Las heparinas no fraccionadas (UFH) y heparinas fraccionadas, derivados de heparina, heparinoides, o bien pentasacáridos, se diferencian en un acción anticoagulatoria. Mientras que UHF inhiben igualmente trombina y factor Xa, LMWH presentan predominantemente una acción inhibidora del factor Xa, y sólo en medida reducida una acción inhibidora de trombina. Los pentasacáridos, como fondaparinux, inhiben selectivamente el factor Xa, y no muestran inhibición de trombina en absoluto.

No obstante, en ciertos cuadros patológicos, como por ejemplo en el caso de una trombocitopenia inducida por heparina (HIT), se debe interrumpir el tratamiento con heparina, y se debe administrar al paciente otros anticoagulantes, preferentemente inhibidores directos de trombina y/o factor Xa. En tales pacientes es necesario disponer de métodos diagnósticos que posibiliten determinar la inhibición de trombina, o bien factor Xa, mediante los inhibidores indirectos, independientemente de la inhibición de trombina, o bien factor Xa, mediante inhibidores indirectos eventuales, como por ejemplo heparina.

La determinación de inhibidores de trombina, o bien factor Xa, se efectúa habitualmente con ayuda de procedimientos de ensayo cromógenos. En estos procedimientos se mezcla la muestra del paciente, que contiene un inhibidor de trombina, o bien factor Xa, con una cantidad definida del correspondiente factor de coagulación activado y un substrato cromógeno para el factor de coagulación activado, y se mide la actividad remanente en la carga de reacción mediante fotometría. Cuanto más elevada es la concentración de inhibidor en la muestra del paciente, tanto más se inhibe la actividad del factor de coagulación añadido, y tanto más reducida es la actividad medida en la carga de reacción. A modo de ejemplo en la EP 0034320 B1 o en la EP 0004271 A2 se describen tales procedimientos de ensayo cromógenos, basados en trombina, o bien factor Xa.

No obstante, en este principio de ensayo es desfavorable que se mide cualquier tipo de actividad inhibidora de trombina, o bien factor Xa, sin poder diferenciar si, o en qué medida, la actividad inhibidora procede de inhibidores de trombina, o bien factor Xa, indirectos o directos.

En el estado de la técnica, este problema se soluciona neutralizándose o reduciéndose la actividad inhibidora de heparina en ensayos en los que se debe medir inhibidores de trombina, o bien factor Xa, distintos a heparina.

En un primer procedimiento conocido se degradan heparinas eventuales contenidas en la muestra mediante la adición de enzimas que degradan heparina, como por ejemplo de heparinasa, para la muestra del paciente. Mediante la actividad de heparinasa se degradan por vía enzimática heparina y todos los derivados de heparina que presentan una secuencia de glucosaminoglucano, mediante lo cual se elimina la actividad inhibidora indirecta, ocasionada por antitrombina, de heparina. Otros inhibidores directos de trombina, o bien factor Xa, que no presentan ninguna secuencia de glucosaminoglucano, son cuantificables tras un tratamiento previo de la muestra. En la patente US 5 262 325 se describe este principio.

En otro procedimiento para la determinación de inhibidores directos de factor Xa en presencia de heparina se añade

a la muestra un factor Xa conjugado con polietilenglicol, y se determina su inhibición con ayuda de un substrato cromógeno. El factor Xa conjugado con polietilenglicol se puede inhibir mediante inhibidores directos de FXa, como por ejemplo rivaroxaban, pero no por complejos de antitrombina-heparina. Por lo tanto, el empleo de factor Xa modificado posibilita la determinación específica de inhibidores directos de factor Xa en presencia de heparina (Posterabstract P17-05, Lange, U. et al.., A simple and specific assay for direct factor Xa inhibitors in plasma without interference by heparins. Kongressausgabe Hámostaseologie 1/2010).

En otro procedimiento conocido para la determinación de inhibidores de factor Xa en presencia de heparina se determina el factor Xa y su inhibición con ayuda de un substrato cromógeno, y en presencia de substancias caotropas. Las substancias caotropas impiden evidentemente la interacción entre antitrombina-heparina, de modo que también este procedimiento es insensible a la acción inhibidora del factor Xa de heparinas, y por lo tanto es apropiado para la determinación específica de inhibidores directos de factor Xa, como por ejemplo rivaroxaban (Posterabstract P01-17, Samama, M.M. et al., Specific and rapid measurement of rivaroxaban usíng a new, dedicated chromogenic assay. Kongressausgabe Hámostaseologie 1/2010).

Otros métodos conocidos para la neutralización de heparina en muestras de pacientes comprenden la adición de policationes, como bromuro de hexadimetrina (Polybrene®) o de sales metálicas, como sales de cobre o cinc, cuyos iones forman un complejo con heparina.

La EP 0 297 597 A2 descubre ya un procedimiento para la determinación de la actividad de inhibidores de serinproteasa. El documento no manifiesta que la carga de reacción se mezcle con un agente que neutraliza el agente oxidante, antes de añadir una cantidad definida de trombina a la carga de reacción.

Resumen de la invención

La invención en su más amplia forma se define en la reivindicación independiente 1:

procedimiento para la determinación de un inhibidor directo de un factor de coagulación en una muestra, seleccionándose el inhibidor directo del factor de coagulación a partir de grupo de inhibidores directos de trombina hirudina, dabigatran, melagatran, argatroban, ximelagatran, bivalirudin, lepirudin, MCC-977,SSR-182289, TGN-255, TGN-167, ARC-183 y odiparcil, o a partir del grupo de inhibidores directos del factor Xa rivaroxaban, apixaban, otamixaban, LY 517717, YM 153, DU-176b, DX-9065a y KFA-1982, presentando el procedimiento los siguientes pasos en el orden citado:

a) mezclado de la muestra con un agente oxidante para dar una carga de reacción;

b) incubación de la carga de reacción;

c) mezclado de la carga de reacción con un agente que neutraliza el agente oxidante;

d) adición de una cantidad definida de factor de coagulación activado trombina o factor Xa a la carga de reacción;

e) determinación de la inhibición del factor de coagulación activado añadido.

En las reivindicaciones dependientes 2-5 se encuentran formas de ejecución preferentes.

Descripción detallada

La presente invención tomaba como base la tarea de poner a disposición otro procedimiento para la determinación específica de inhibidores del factor de coagulación, que sea insensible frente a heparina y sus derivados, y que se pueda automatizar fácilmente en un sistema de medida de coagulación.

1.- Procedimiento para la determinación de un inhibidor directo de un factor de coagulación en una muestra, siendo seleccionado el inhibidor directo del factor de coagulación a partir del grupo de inhibidores directos de trombina hirudina, dabigatran, melagatran, argatroban, ximelagatran, bivalirudin, lepirudin, MCC-977.SSR-182289, TGN-255, TGN-167, ARC-183 y odiparcil, o a partir del grupo de inhibidores directos del factor Xa rivaroxaban, apixaban, otamixaban, LY 517717, YM 153, DU-176b, DX-9065a y KFA-19982, presentando el procedimiento los siguientes pasos en el orden citado:

a) mezclado de la muestra con un agente oxidante para dar una carga de reacción;

b) incubación de la carga de reacción;

c) mezclado de la carga de reacción con un agente que neutraliza el agente oxidante;

d) adición de una cantidad definida de factor de coagulación activado trombina o factor Xa a la carga de

reacción;

e) determinación de la inhibición del factor de coagulación activado añadido.

2 - Procedimiento según la reivindicación 1, mezclándose en el paso a) la muestra con un agente oxidante del grupo hipocloruros y sus sales, en especial hipoclorito sódico o potásico, reactivos halógenos, peróxidos de hidrógeno, ácido peroxomonosulfúrico, ácido peroxodisulfúrico, cloramina B, cloramina T, ácido hipocloroso, N- clorosuccinimida, o sus sales.

3.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, mezclándose en el paso c) la carga de reacción con un agente de neutralización del grupo ácido halogenados, preferentemente disoluciones acuosas de bajo peso molecular de ácidos clorhídricos, de modo especialmente preferente ácido clorhídrico; fructosa; poliol, ácidos de frutas y sus sales.

4 - Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, ascendiendo el tiempo de incubación en el paso b) al menos a 30 segundos, preferentemente 30 a 180 segundos, de modo especialmente preferente 90 a 120 segundos.

- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, añadiéndose además tras el paso c) a la carga de reacción un substrato cromógeno, fluorógeno, o marcado de otro modo, que se disocia específicamente por el factor de coagulación activado trombina o el factor Xa, y midiéndose la cantidad de producto de disociación liberado que produce la señal.