Preparados de fibrinógeno enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida.

Un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total,

y en donde al menos 10% (p/p) del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos, y en donde el Fib420 se prepara mediante tecnología recombinante.

Preparados de fibrinógeno enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida Campo de la invención La presente invención se refiere a preparados de fibrinógeno y al uso de preparados de fibrinógeno en aplicaciones médicas. En particular, se refiere al uso de preparados de fibrinógeno que están enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida.

Antecedentes de la invención El fibrinógeno es una glicoproteína del plasma soluble que se sintetiza en el cuerpo humano, principalmente por parte de células del parénquima del hígado. Es una molécula dimérica, que consiste en dos pares de tres cadenas polipeptídicas designadas Aα, Bβ y , que están conectados por puentes disulfuro. Las tres cadenas polipeptídicas son codificadas por tres genes separados. La forma predominante (HMW fib) alberga una cadena Aα que se sintetiza como un precursor de 625 aminoácidos y está presente en el fibrinógeno encontrado en el plasma sanguíneo como una cadena polipeptídica de 610 amino ácidos, la cadena Bβ contiene 461 y la cadena  411 aminoácidos. Los tres polipéptidos se sintetizan individualmente a partir de 3 ARNms. El ensamblaje de las tres cadenas componentes (Aα, Bβ y ) en su forma final como un dímero de seis cadenas (Aα, Bβ, ) 2 se produce en el lumen del retículo endoplasmático (ER -siglas en inglés) .

El fibrinógeno circula en la sangre en concentraciones altas (1-2 g/L) y demuestra un alto grado de heterogeneidad. Se estima que en cada individuo circulan aproximadamente un millón de diferentes moléculas de fibrinógeno. La mayoría de estas variantes, que representan sólo una pequeña porción del fibrinógeno total (en la mayoría de los casos no más de unos pocos porcentajes) , difieren en la función y estructura.

La proteólisis de la parte carboxi-terminal de la cadena Aα resulta en tres formas circulantes de fibrinógeno principales que tienen claramente diferentes pesos moleculares. El fibrinógeno se sintetiza en la forma de alto peso molecular (HMW; peso molecular 340 kDa; la forma predominante de cadenas Aα en la circulación contiene 610 aminoácidos) . La degradación de una de las cadenas Aα da lugar a la forma LMW (PM = 305 kDa) ; la forma LMW’ (270 kDa) es la variante en la que las dos cadenas de Aα están parcialmente degradadas en el extremo carboxi. En la sangre de individuos sanos, 50 -70% del fibrinógeno es HMW, 20 -50% es fibrinógeno con una o dos cadenas Aα degradadas (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) . Las variantes HMW y LMW’ muestran claras diferencias en el tiempo de coagulación y en la estructura de polímero de fibrina (Hasegawa N, Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57, 183) .

Variantes bien conocidas que son el resultado de corte y empalme alternativo son las llamadas variante gamma prima (') y la variante α-ext Fib o Fib420.

La variante α-ext Fib o Fib420, que tiene un peso molecular de 420 kDa, representa el 1-3% del fibrinógeno circulante total (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) . La isoforma α-ext Fib extendida se distingue de la cadena α convencional de fibrinógeno por la presencia de un dominio globular en el extremo C de 236 residuos adicional debido al corte y empalme alternativo. En la bibliografía se dan datos contradictorios sobre la función y las características de Fib420. Sobre la base de estudios con α-ext Fib derivada de plasma, Applegate et al, Blood (2000) 95: 2297, llegaron a la conclusión de que las propiedades de polimerización y reticulación de un α-ext Fib no son totalmente diferentes de HMW Fib derivada de plasma. Concluyen que el dominio C adicional no tiene efecto alguno sobre la coagulación y sugieren que la función del dominio puede ser para apoyar la adhesión celular mediada por la integrina. En el documento EP 1 495 051 se sugiere que Fib420 podría ser menos sensible a la degradación y podría tener un efecto sobre la estructura del coágulo. Sin embargo, no se da justificación alguna y no hay sugerencia alguna en cuanto a si el efecto puede ser una mejora o un deterioro en la estructura o resistencia del coágulo. Mosesson et al. (Biophys. Chem. 112, 209: 2004) han estudiado la ultraestructura de los coágulos que se basan en α-ext Fib derivada de plasma del cordón umbilical. Informaron que las fibras de los coágulos de α-ext Fib son más delgadas y están más ramificadas que las basadas en fibrinógeno HMW, pero tienen la misma periodicidad que caracteriza a todas las fibras de fibrina. Los autores sugieren que la probable función para la cadena α extendida en α-ext Fib es proporcionar sitios para la interacción con integrinas celulares.

Descripción detallada La presente invención se refiere a un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total, y en donde al menos el 10% del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos

hemorrágicos, y en donde el Fib420 se prepara mediante tecnología recombinante.

En el sector, a Fib420 también se le alude como 'α-ext Fib', 'fibrinógeno con una cadena alfa extendida" o "fibrinógeno420'. En el presente contexto, estos términos y expresiones se utilizan indistintamente. Todos estos términos y expresiones se refieren a una molécula simétrica de la estructura (Aαext, Bβ, ) , en donde tanto las cadenas α de fibrinógeno convencionales tal como se encuentran en HMW fib, han sido reemplazados por cadenas alfa extendidas.

En el presente contexto, la expresión ‘preparado de fibrinógeno' se refiere al fibrinógeno en forma aislada, por ejemplo, a un aislado de plasma o aislado de sobrenadante celular de fibrinógeno. También puede referirse a un preparado sintético de fibrinógeno. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es un preparado puro en el que sustancialmente no están presentes contaminantes tales como proteínas y contiene preferiblemente al menos 95% p/p, por lo menos 96% p/p, por lo menos 97% p/p o por lo menos 98% p/p de fibrinógeno, basado en la proteína total. Lo más preferiblemente, un preparado de fibrinógeno de acuerdo con la invención comprende al menos 99% p/p o al menos 99, 5% p/p de fibrinógeno, basado en la proteína total. Preparados de fibrinógeno puros de este tipo son particularmente adecuadas para formular composiciones que se utilizan en aplicaciones médicas, es decir, composiciones para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos.

De acuerdo con la invención, al menos 10% p/p del fibrinógeno en el preparado está en forma de Fib420. Preferiblemente, al menos 15% p/p, por lo menos 20% p/p, por lo menos 25% p/p o por lo menos 30% p/p del fibrinógeno está en forma de Fib420. Más preferiblemente, por lo menos 40% p/p, por lo menos 50% p/p, por lo menos 60% p/p, por lo menos 70% p/p, por lo menos 80% p/p o por lo menos 90% p/p está en forma de Fib420. Lo más preferiblemente, por lo menos 95% p/p, por lo menos 99% p/p o todo el fibrinógeno está en forma de Fib420. Una ventaja del preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es que la digestión mediada por plasmina del preparado de fibrinógeno es más lenta que para el fibrinógeno derivado del plasma. Su mayor resistencia a la digestión por plasmina es probable que sea beneficiosa para el tratamiento de pacientes que padecen hiperfibrinolisis, que a menudo se observa en casos de coagulopatía adquirida.

Esto significa que la estabilidad del coágulo de fibrina se mejora debido al uso de acuerdo con la invención y que el preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es más potente que los preparados del estado de la técnica. El uso de un preparado de fibrinógeno más potente permite la reducción tanto de la cantidad de fluido como la cantidad de proteína terapéutica a administrar. Esto es una ventaja para el uso por vía intravenosa para tratar la coagulopatía dilucional. Actualmente, para la inyección intravenosa (i.v.) de fibrinógeno para compensar la baja actividad de coagulación de la sangre, se requieren altas dosis de fibrinógeno (~ 5 gramos de fibrinógeno por tratamiento) . Éste se administra mediante inyección directa a una dosis de 70 mg/kg. Dado que el fibrinógeno, en general, puede ser disuelto en una concentración máxima de 20 mg/ml, esto significa que aproximadamente 250 ml de fluido tienen que ser administrados por vía intravenosa a un adulto. Sería beneficiosa la reducción... [Seguir leyendo]

1. Un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total, y en donde al menos 10% (p/p) del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos, y en donde el Fib420

se prepara mediante tecnología recombinante.

2. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Fib240 se prepara mediante un método que comprende:

-proporcionar un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de

polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno; -transformar una célula de mamífero con el vector de expresión; -mantener la célula de mamífero transformada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno.

3. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno está optimizada para la expresión en un sistema de cultivo de células de mamífero.

4. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia optimizada de acuerdo con SEQ ID Nº 5.

5. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, en donde la célula de mamífero es una célula humana.

6. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 2-5, en donde la célula de mamífero es una célula PER.C6.