Polipéptidos de direccionado específico a células diana de Otx2.

Polipéptido de direccionado celular, caracterizado porque se define mediante la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID nº 1),

en la que:

B1, B2, B3, B4, B5 y B6 representan, independientemente, arginina o lisina;

X1 y X8 representan, independientemente, asparginina o glutamina;

X2 representa ácido aspártico o ácido glutámico;

X3, X4 y X6 representan, independientemente, treonina o serina;

X5 representa fenilalanina, tirosina o triptófano;

X7 representa alanina o glicina;

X9 representa leucina, isoleucina o valina.

y porque cuando se pone en presencia de células retinianas, se une específicamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.

Polipïptidos de direccionado especïfico a cïlulas diana de Otx2.

La presente invenciïn se refiere a unos polipïptidos que permiten el direccionado especïfico de una molïcula de interïs a cïlulas diana de la homeoproteïna Otx2 y, en particular, de las neuronas ganglionares y de las neuronas bipolares retinianas.

La retina es la capa celular que cubre el fondo del ojo. Contiene diferentes tipos de neuronas, cuya funciïn es captar la energïa luminosa y transformarla en seïal nerviosa, y tambiïn contiene cïlulas gliales.

Esquemïticamente, la retina comprende tres capas principales de neuronas: las neuronas fotorreceptoras (conos y bastones) , las neuronas bipolares y las neuronas ganglionares; otras neuronas, las neuronas amacrinas y las neuronas horizontales desempeïan un papel regulador. Las neuronas fotorreceptoras reaccionan con la luz, y la seïal que generan es transmitida por medio de neuronas bipolares, a las neuronas ganglionares, cuyos axones constituyen las fibras nerviosas del nervio ïptico, asegurando el envïo de la informaciïn al cerebro.

La degeneraciïn de las neuronas retinianas estï implicada en diversas retinopatïas. Asï, la degeneraciïn de las neuronas fotorreceptoras esta implicada en ciertas patologïas, tales como la retinitis pigmentaria o la degeneraciïn macular. En otras patologïas, tales como el glaucoma, son principalmente las neuronas ganglionares las que estïn afectadas.

La Otx2 (Orthodenticle homolog 2) es una homeoproteïna que contiene un homeodominio de tipo bicoide (SIMEONE y otros, Embo J, 12, 2735-47, 1993) . Pertenece a la familia de las homeoproteïnas Otx, que desempeïan un papel fundamental en el desarrollo del cerebro durante la embriogïnesis (ACAMPORA y otros, Prog Neurobiol, 64, 69-95, 2001; SIMEONE y otros, Curr Opin Genet Dev, 12, 409-15, 2002) .

Con ocasiïn de trabajos anteriores, el equipo de inventores ha puesto en evidencia el efecto positivo de una homeoproteïna, Otx2 (Orthodenticle homolog 2) sobre la supervivencia de las neuronas ganglionares retinianas. Estos resultados se detallan en la solicitud PCT WO/2009/106767.

Se ha demostrado tambiïn que la Otx2 desempeïaba un papel en el desarrollo postnatal de la corteza cerebral, y en particular en su plasticidad. La Otx2, que es sintetizada a nivel de la retina, es transportada hasta la corteza cerebral visual, en la que es capturada por las neuronas parvalbïminas de la corteza cerebral visual, lo que induce su maduraciïn, y conlleva, en primer lugar, la apertura y a continuaciïn, poco tiempo despuïs, el cierre del periodo crïtico de plasticidad (SUGIYAMA y otros, Cell, 134, 508-20, 2008) .

Un periodo crïtico de plasticidad es una fase del desarrollo postnatal representada por un intervalo de tiempo de duraciïn limitada (variable segïn la especie animal, y segïn la funciïn sensorial en cuestiïn) , durante el cual los estïmulos sensoriales son capaces de modificar la organizaciïn funcional de las zonas corticales correspondientes.

Al llevar a cabo sus investigaciones, los inventores han descubierto que en la retina, la Otx2 se fijaba especïficamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares, y han identificado la regiïn de la Otx2 responsable de esta fijaciïn. Han demostrado ademïs que esta misma regiïn era tambiïn responsable del direccionado de la Otx2 hacia las neuronas parvalbïminas de la corteza cerebral visual, interactuando con la red perineuronal de proteoglicanos de sulfato de condroitina, que recubre estas neuronas, y que permitïa, entrando en competiciïn con la proteïna Otx2 endïgena capturada por las neuronas parvalbïminas, inhibir esta captura. Esta inhibiciïn conlleva el retorno de estas neuronas a un estado inmaduro, permitiendo la reapertura de la fase crïtica de plasticidad.

La regiïn responsable del direccionado de la Otx2 de sus cïlulas diana estï constituida por una secuencia peptïdica de 15 aminoïcidos. Los inventores han constatado ademïs que este polipïptido, aislado, poseïa la misma especificidad de fijaciïn que la proteïna Otx2 entera.

La presente invenciïn tiene por objeto un polipïptido de direccionado celular aislado definido por la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID nï 1) , en la que:

B1, B2, B3, B4, B5 yB6 representan, independientemente, arginina o lisina; X1 yX8 representan, independientemente, asparginina o glutamina; X2 representa ïcido aspïrtico o ïcido glutïmico; X3, X4 yX6 representan, independientemente, treonina o serina; X5 representa fenilalanina, tirosina o triptïfano; X7 representa alanina o glicina; X9 representa leucina, isoleucina o valina.

Este polipïptido, en presencia de cïlulas retinianas, se une especïficamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.

Unos modos de realizaciïn preferidos de la presente invenciïn son polipïptidos en los que:

-al menos uno de los aminoïcidos B1, B3, B4, B5 yB6 es una arginina; y/o -B2 es una lisina; y/o -al menos uno de los aminoïcidos X1 yX8 es una glutamina; y/o -X2 es un ïcido glutïmico; y/o -al menos uno de los aminoïcidos X3 X4 yX6 es una treonina; y/o -X5 es una fenilalanina; y/o -X7 es una alanina; y/o -X9 es una leucina.

Segïn un modo de realizaciïn particularmente preferido de un polipïptido de direccionado celular conforme a la invenciïn, ïste estï definido por la secuencia siguiente: RKQRRERTTFTRAQL (SEC ID nï 2) .

Los aminoïcidos que constituyen un polipïptido conforme a la invenciïn, pueden ser aminoïcidos naturales, de la serie L. Se puede sustituir tambiïn todo o parte de estos aminoïcidos por sus isïmeros de la serie D, a fin de aumentar la estabilidad del polipïptido in vivo. Los aminoïcidos, de la serie L o de la serie D, pueden tambiïn, llegado el caso, estar encadenados segïn una secuencia inversa de la secuencia SEC ID nï 1 o de la secuencia SEC ID nï 3, indicadas anteriormente.

La presente invenciïn tiene tambiïn por objeto la utilizaciïn de un polipïptido de direccionado celular conforme a la invenciïn, para permitir el direccionado especïfico de una carga de interïs de cïlulas diana de la Otx2.

Como ejemplos de cïlulas diana de la Otx2 se citarïn, ademïs de las neuronas ganglionares y de las neuronas bipolares retinianas ya mencionadas anteriormente, las neuronas recubiertas de una red perineuronal de proteoglicanos de sulfato de condroitina, que incluyen, en particular, neuronas que expresan la parvalbïmina (neuronas PV) localizadas en particular en la corteza cerebral visual. Otras cïlulas diana de la Otx2 son unas neuronas del cerebro medio, en particular las neuronas dopaminïrgicas de la sustancia negra y del ïrea tegmental ventral, y sus dianas sinïpticas.

Otras cïlulas dianas de la Otx2 pueden fïcilmente ser identificadas con la ayuda de un polipïptido de direccionado conforme a la invenciïn, por ejemplo asociando dicho polipïptido a un marcador, poniendo en contacto dicho polipïptido marcado con una muestra de un tejido o de un ïrgano a ensayar, y detectando, en dicha muestra, la presencia o la ausencia de cïlulas que fijan dicho polipïptido y, en caso de presencia de cïlulas que fijan dicho polipïptido, su localizaciïn.

Se designa bajo el tïrmino general de: "carga" cualquier molïcula o complejo molecular que se desea dirigir a una cïlula diana.

Las cargas que pueden ser transportadas por polipïptidos de direccionado celular conformes a la invenciïn, pueden ser de naturaleza muy variada: puede tratarse de molïculas quïmicas, de macromolïculas, tales como, por ejemplo, unas proteïnas o ïcidos nucleicos, o partïculas tales como los liposomas, nanopartïculas o partïculas virales o pseudovirales. Puede tratarse de marcadores destinados a permitir la detecciïn y/o la localizaciïn de cïlulas diana de la Otx2 en un tejido o un ïrgano, o de principios activos que se desea dirigir especïficamente a las cïlulas diana de la Otx2.

Si se desea obtener no solamente el direccionado de la carga de interïs de la cïlula diana, sino tambiïn su entrada en esta, se puede asociar ventajosamente un polipïptido de direccionado celular conforme a la invenciïn, con un polipïptido transductor.

Los polipïptidos transductores son polipïptidos que comprenden una secuencia denominada "dominio de transducciïn", que les confiere la capacidad de penetrar en el interior de una cïlula viva, independientemente de la presencia de transportadores o de receptores especïficos.

Un gran nïmero de polipïptidos transductores son conocidos por sï mismos. Como ejemplos no limitativos, se citarïn: las penetratinas, que son polipïptidos derivados de la tercera hïlice de un homeodominio; los polipïptidos derivados de la proteïna... [Seguir leyendo]

1. Polipïptido de direccionado celular, caracterizado porque se define mediante la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID nï 1) , en la que:

B1, B2, B3, B4, B5 yB6 representan, independientemente, arginina o lisina; X1 yX8 representan, independientemente, asparginina o glutamina; X2 representa ïcido aspïrtico o ïcido glutïmico; X3, X4 yX6 representan, independientemente, treonina o serina; X5 representa fenilalanina, tirosina o triptïfano; X7 representa alanina o glicina; X9 representa leucina, isoleucina o valina.

y porque cuando se pone en presencia de cïlulas retinianas, se une especïficamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.

2. Polipïptido de direccionado celular, segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado porque:

- al menos uno de los aminoïcidos B1, B3, B4, B5 yB6 es una arginina; y/o -B2 es una lisina; y/o -al menos uno de los aminoïcidos X1 yX8 es una glutamina; y/o -X2 es un ïcido glutïmico; y/o -al menos uno de los aminoïcidos X3 X4 yX6 es una treonina; y/o -X5 es una fenilalanina; y/o -X7 es una alanina; y/o -X9 es una leucina.

3. Polipïptido de direccionado celular, segïn la reivindicaciïn 2, caracterizado porque estï definido por la secuencia siguiente: RKQRRERTTFTRAQL (SEC ID nï 2) .

4. Polipïptido que contiene un polipïptido de direccionado celular, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un polipïptido transductor.

5. Composiciïn que comprende un polipïptido, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unido a una carga de interïs.

6. Composiciïn, segïn la reivindicaciïn 5, caracterizada porque estï constituida por un polipïptido quimïrico que contiene un polipïptido segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o varios polipïptidos que constituyen la carga.

7. Composiciïn, segïn la reivindicaciïn 6, caracterizada porque dicho polipïptido quimïrico contiene: -un polipïptido segïn la reivindicaciïn 4, y -una carga que comprende una o varias secuencias de regulaciïn de la transcripciïn y/o una o varias secuencias

de regulaciïn de la traducciïn.

8. Utilizaciïn de un polipïptido, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el direccionado especïfico in vitro de una carga de interïs de unas cïlulas dianas de Otx2.

9. Polipïptido, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para una utilizaciïn de diagnïstico o terapïutica que permite el direccionado especïfico de una carga de interïs de unas cïlulas dianas de Otx2.

10. Utilizaciïn de un polipïptido, segïn la reivindicaciïn 4, para el direccionado especïfico in vitro de una carga de interïs de unas cïlulas diana de Otx2 y la internalizaciïn de dicha carga en dichas cïlulas.

11. Polipïptido, segïn la reivindicaciïn 4, para una utilizaciïn de diagnïstico o terapïutica que permite el direccionado especïfico de una carga de interïs de unas cïlulas dianas de Otx2, y la internacionalizaciïn de dicha carga en dichas cïlulas.

12. Utilizaciïn de una composiciïn, segïn la reivindicaciïn 7, para aumentar in vitro la supervivencia de las cïlulas diana de Otx2.

13. Composiciïn, segïn la reivindicaciïn 7, para la utilizaciïn como medicamento para prevenir o tratar la degeneraciïn de cïlulas diana de Otx2.

14. Utilizaciïn, segïn cualquiera de las reivindicaciones 8, 10 ï 12, caracterizada porque dichas cïlulas diana de Otx2 son neuronas ganglionares o neuronas bipolares retinianas.

15. Polipïptido, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la utilizaciïn como medicamento que inhibe la fijaciïn de Otx2 a las neuronas parvalbïminas, para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre la ambliopïa, los trastornos ansiosos, el sïndrome del estrïs post-traumïtico, la psicosis maniaco-depresiva y la esquizofrenia.