Péptido antimicrobiano, formas ramificadas del mismo y su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Un péptido antibacteriano que consiste de la secuencia de aminoácidos KKIRVRLSA, caracterizado porque todos los aminoácidos están en configuración D.

Péptido antimicrobiano, formas ramificadas del mismo y su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un péptido con actividad antimicrobiana fuerte contra bacterias Gram negativas y Gram positivas y cepas de Candida, con todos los aminoácidos de la secuencia peptídica que están en configuración D. El péptido es particularmente resistente a la proteólisis cuando se sintetizan en la forma tetra ramificada donde secuencias peptídicas idénticas se unen entre sí por un andamiaje molecular apropiado. Esta forma hace al péptido particularmente adecuado para aplicaciones clínicas.

Antecedentes de la técnica La emergencia cada vez mayor de bacterias resistentes a multifármacos es un asunto global, en general en aquellos países donde los antibióticos se usan ampliamente en clínicas. Un número de patógenos como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, algunos enterococos, Pseudomonas aeruginosa y muchas otras bacterias desarrollan resistencia contra los antibióticos más tradicionales así como también contra aquellos de nueva generación (Wenzel y Edmond 2000) . Por lo tanto se vuelve cada vez más importante desarrollar nuevos antibióticos. Esta demanda insta a la comunidad de investigadores y a las compañías farmacéuticas a considerar agentes antimicrobianos nuevos. Los péptidos antimicrobianos se consideran unas de las mejores alternativas para antibióticos tradicionales que generalmente causan la selección de bacterias resistentes (Hancock y Sahl, 2006) . Los péptidos más antimicrobianos son componentes de la inmunidad innata de los animales, que incluyen humanos, plantas y hongos (Zasloff, 2002) . Usualmente ellos consisten de 6-50 residuos aminoacídicos y tienen una carga neta positiva. Los péptidos catiónicos interactúan selectivamente con membranas bacterianas aniónicas y con otras estructuras cargadas negativamente tales como LPS y ADN. Las membranas eucarióticas, en su capa externa, normalmente se cargan menos negativamente que la de las bacterias, y, de forma diferente a la membrana bacteriana, ellas además se estabilizan por moléculas de colesterol. Estas diferencias son la base de la especificidad de los péptidos catiónicos. El mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos catiónicos se debe por consiguiente a su aglutinación específica a las membranas bacterianas, que provoca la permeación celular y, en algunos casos, la inhibición de las vías metabólicas.

Muchos estudios después, dirigidos a la identificación y caracterización de secuencias peptídicas antimicrobianas mediante el estudio de su mecanismo de acción, su toxicidad para células eucarióticas y su eficacia terapéutica cuando se administran en forma tópica o en forma sistémica. Desafortunadamente, hasta ahora dos problemas principales dificultaron el desarrollo de fármacos peptídicos antimicrobianos. El primero es que la selectividad de los péptidos antimicrobianos naturales es generalmente demasiado baja para bacterias y ellos parecen ser muy tóxicos para células eucarióticas, particularmente eritrocitos, lo que genera un alto nivel de hemólisis. El segundo se relaciona a la vida media generalmente corta de los péptidos in vivo. Estas son las razones principales por las que solo pocos péptidos catiónicos alcanzaron el mercado en los últimos 10 años (la polimixina y la daptomicina son ejemplos exitosos) .

Hace pocos años, los investigadores comenzaron a concentrarse en la identificación de secuencias peptídicas novedosas de origen no natural, seleccionadas en el laboratorio mediante diseño racional o tamizaje de librerías combinatoriales. La intención fue encontrar péptidos con mejores propiedades biológicas en términos de toxicidad general y especificidad para bacterias y vida media mejorada para el desarrollo de fármacos.

En el laboratorio de los inventores, se identificaron las secuencias peptídicas no naturales, las que mostraron una actividad antimicrobiana fuerte especialmente contra bacterias Gram negativas (Pini y otros, 2005; Pini y otros, 2007; Pini y otros, 2010) . La última versión mejorada de estos péptidos se llamó M33 (secuencia KKIRVRLSA; documento WO 2010/038220 A1) y se probó in vitro para su capacidad de neutralizar LPS bacteriano e in vivo para su actividad antibacteriana y antinflamatoria en sepsis de modelos animales (Pini y otros, 2010) . El péptido M33 pareció selectivo para bacterias Gram negativas con una ligera actividad contra solo dos cepas del Staphylococcus aureus Gram positivo. El péptido M33 se usó y describió en Pini y otros, 2010 y en WO2010/038220A1 siempre con aminoácidos en configuración L (L-M33) . Sorprendentemente, la síntesis de la misma secuencia peptídica con todos los aminoácidos en configuración D (D-M33) produjo no solo una mejor actividad para algunas bacterias Gram negativas sino además una fuerte actividad contra un panel de bacterias Gram positivas y hongos para los que el L-M33 no fue activo para nada. Este resultado es completamente inesperado, en que la sustitución de L aminoácido con su configuración D se conoce que incrementan la estabilidad peptídica pero el efecto en la selectividad no fue predecible.

Descripción de la invención Es un objetivo de la presente invención la secuencia peptídica KKIRVRLSA caracterizado porque todos los aminoácidos están en configuración D (de aquí en adelante referido como D-M33) , ya sea en la forma lineal (es decir monomérica) o multimerizada (es decir dendrimérica o ramificada) en un esqueleto de poliacrilamida, en un esqueleto de unidades de dextrano o en un esqueleto de unidades de etilenglicol, o, preferentemente, en un andamiaje que sigue la Fórmula general (I)

5 en la cual R es el péptido reivindicado en la reivindicación 1 y descrito anteriormente; X es al menos una molécula bifuncional (en configuración R o S si es asimétrica) , y:

10 m=n= 0 y p=1, donde el péptido es un dímero de la Fórmula (Ia) ;

o m=1, p=1 y n= 0, donde el péptido es un tetrámero de la Fórmula (Ib) ;

o m=n=p=1, donde el péptido es un octámero de la Fórmula (Ic) .

El grupo X comprende preferentemente al menos dos grupos amino funcionales, los que preferentemente se suministran por diaminoácidos tales como ornitina, norlisina, aminoalanina o ácido diaminopropiónico, ya sean solos o unidos a residuos aminoacídicos diferentes por un enlace peptídico, particularmente β-ala.

Alternativamente, el grupo X se selecciona de un grupo que consiste de ácido aspártico, propilenglicol, ácido succínico, un diisocianato, o N, N-bis (3-aminopropilo) -glicina (BAPG) u otra poliamina dendrimérica o moléculas poliacídicas.

Los andamiajes basados en poliamina dendrimérica de acuerdo con la invención pueden prepararse al seguir los procedimientos descritos en Tam, 1988; Tam y otros, 2002, Falciani y otros, 2005; Stasko y Schoenfisch, 2006; Rudovskà y otros, 2006, los que se incorporan en la presente invención como referencia.

Es un objetivo adicional de la invención el péptido como se describe anteriormente para uso médico, preferentemente como un medicamento antibacteriano.

Es un objetivo adicional de la invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable y eficaz del péptido como se describe anteriormente. La composición puede estar en la forma de una solución inyectable para administración sistémica, preferentemente en la forma de una solución inyectable para usar como agente desintoxicante para la neutralización de LPS, aún preferentemente en la forma de colirio, enjuague bucal, ungüento, aerosol, o solución para administración tópica.

Es un objetivo adicional de la invención un preparado desinfectante y/o detergente con actividad antibacteriana que comprende el péptido de la invención.

Es un objetivo adicional de la invención el uso del péptido de la invención como un conservante para la preparación de productos alimenticios y/o de productos cosméticos y/o de productos homeopáticos.

Es otro objetivo de la presente invención el uso de tal péptido como agente antimicrobiano para aplicaciones médicas, veterinarias y agronómicas.

El péptido de la invención es ventajoso en comparación con los péptidos M6 o L-M33 ya descritos, en EP 1 789 436 B1 y en documento WO 2010/038220 A1, respectivamente, por su mejor eficacia contra Gram negativas y especialmente por su actividad contra bacterias Gram positivas como se muestra en las siguientes tablas. Esta característica crucial, junto con su actividad antimicrobiana muy esperanzadora, hace al péptido D-M33 un candidato óptimo para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos para... [Seguir leyendo]

1. Un péptido antibacteriano que consiste de la secuencia de aminoácidos KKIRVRLSA, caracterizado porque todos los aminoácidos están en configuración D.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, dicho péptido que está en la forma de péptido lineal.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, dicho péptido está multimerizado en un esqueleto de poliacrilamida, en un esqueleto de unidades de dextrano o en un esqueleto de unidades de etilenglicol.

4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, dicho péptido está multimerizado en un andamiaje que tiene la siguiente Fórmula (I)

en la cual R es el péptido reivindicado en la reivindicación 1; X es al menos una molécula bifuncional, y: m=n= 0 y p=1, donde el péptido es un dímero de la Fórmula (Ia)

o m=1, p=1 y n= 0, donde el péptido es un tetrámero de la Fórmula (Ib)

o m=n=p=1, donde el péptido es un octámero de la Fórmula (Ic)

5. El péptido multimerizado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde X comprende al menos dos grupos 5 amino funcionales.

6. El péptido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde X es un aminoácido seleccionado de lisina, ornitina, norlisina, amino alanina o ácido diaminopropiónico, o un dipéptido que contiene uno de estos aminoácidos.

7. El péptido de acuerdo con reivindicación 6, en donde dicho péptido se representa por la siguiente fórmula química:

8. El péptido multimerizado de acuero con la reivindicación 4, en donde X se selecciona de ácido aspártico, ácido glutámico, propilenglicol, ácido succínico, un diisocianato, N, N-bis (3-aminopropilo) -glicina (BAPG) .

9. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso médico.

10. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores como un fármaco antibacteriano.

11. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usar en el tratamiento de las 25 infecciones causadas por bacterias Gram positivas.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-8.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en la forma de solución inyectable para la

administración sistémica, o en la forma de colirio, enjuague bucal, ungüento, o solución para administración tópica.

14. Un preparado desinfectante y/o detergente con actividad antibacteriana que comprende al péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8.

15. Uso del péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 como un conservante para alimento, cosmético o productos homeopáticos.