Métodos, reactivos y kits para inmunofenotipado por citometría de flujo.

Una composición reactiva para inmunofenotipado por citometría de flujo de leucocitos que comprende al menos ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes que comprende un conjunto de al menos tres anticuerpos de identificación para la identificación de una población de leucocitos de interés y al menos cuatro anticuerpos de caracterización para una caracterización adicional y/o la clasificación de dicha población de leucocitos,

en donde los anticuerpos están dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores: CD20, CD4, CD45, CD19, Igλ, CD8, Ig κ, CD56, CD5, TCRγδ, CD3 y CD38, en donde el anticuerpo dentro de los pares CD20/CD4, Igλ/CD8 y CD19 /TCRγ δ se conjuga al mismo fluorocromo, y en donde entre diferentes pares los fluorocromos son distinguibles.

Métodos, reactivos y kits para inmunofenotipado por citometría de flujo La invención se relaciona con el campo de la citometría de flujo y más particularmente con un panel de reactivos de anticuerpo conjugado con compuestos fluorescentes. Encuentran su uso en la caracterización inmunofenotípica de células normales, reactivas, regeneradoras y neoplásicas en sangre periférica (PB) , médula ósea (BM) , derrame pleural, ascitis, fluido cerebroespinal (CSF) , humor vítreo, fluido sinovial, lavado broncoalveolar, orina, bazo, hígado, nódulos linfáticos, y otras muestras de tejido. El inmunofenotipado por citometría de flujo de células normales, reactivas, regeneradoras y malignas (particularmente leucocitos) actualmente se usa para muchas aplicaciones en medicina, que incluyen inmunología, hematología y oncología. Entre otras, dichas aplicaciones incluyen el monitoreo del sistema inmune; diagnóstico y clasificación de inmunodeficiencias primarias; inmunofenotipado de leucemias, linfomas y discrasias de células plasmáticas; monitoreo de frecuencias bajas de leucocitos malignos como medida de la efectividad del tratamiento; diagnóstico y monitoreo de trastornos clonales tales como hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) y mastocitosis; evaluación de la hematopoyesis o linfopoyesis en diferentes afecciones clínicas, por ejemplo, en individuos sanos, después de trasplante de células madre o terapia génica (por medio del uso de células precursoras hematopoyéticas como objetivo) ; y la evaluación de la composición y la calidad de los productos celulares que se usarán para fines terapéuticos.

El proceso de diagnóstico convencional en el inmunofenotipado por citometría de flujo típicamente se basa en el uso de paneles de anticuerpos. En la actualidad se recomiendan para aplicaciones específicas diferentes paneles de anticuerpos de superposición. Estos paneles se accionan ya sea por indicación médica (por ejemplo: detección de citopenias, caracterización de linfocitosis) , por enfermedad (por ejemplo: diagnóstico de la leucemia aguda, diagnóstico de linfoma) o estado de la enfermedad (por ejemplo: clasificación diagnóstica de ALL vs. monitoreo de ALL para la evaluación de la efectividad del tratamiento) . Ejemplos de paneles de anticuerpos recomendados están en la Red de Leucemia Europea (ELN) (1) , los paneles del Consenso Internacional de Bethesda de 2006 (2) para diferentes subtipos de neoplasias malignas hematológicas, los paneles de EGIL para la asignación de linaje y subclasificación de las leucemias agudas (3) , los paneles de la Red Europea de Mieloma (EMN) para el diagnóstico, clasificación y monitoreo de discrasias de células plasmáticas (4) , los paneles de puntuación de ERIC (5) y Matutes (6) para la subclasificación inmunofenotípica de leucemia linfocítica crónica y leucemia de células peludas vs. otros trastornos linfoproliferativos crónicos.

Estos paneles de anticuerpos recomendados son en su mayoría comparables entre los diferentes países y grupos de estudio, pero nunca totalmente idénticos. Es importante destacar que las distintas redes y grupos de estudio han proporcionado poca o ninguna información sobre cómo los anticuerpos se deben combinar preferentemente en un panel de reactivos de anticuerpos conjugados con compuestos de fluorescencia específicos. Sólo se han propuesto listas simples de anticuerpos, incluso cuando los laboratorios de diagnóstico pueden teñir simultáneamente una alícuota de la muestra con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más anticuerpos conjugados con diferentes colorantes fluorescentes que tienen emisiones de fluorescencia que se pueden medir por separado. Las variaciones entre centros de todo el mundo se deben al uso de:

− Listas comparables pero no idénticas de anticuerpos y clones de anticuerpos; − Los mismos anticuerpos conjugados con diferentes fluorocromos que muestran diferentes sensibilidades. Por

ejemplo, un reactivo de anticuerpo podría proporcionar un resultado negativo si el anticuerpo se combina con un fluorocromo de baja sensibilidad, mientras que un resultado positivo se podría obtener si un reactivo de anticuerpo que consiste en el mismo anticuerpo combinado con un fluorocromo diferente, más sensible, se usa para teñir las mismas células. − Evaluación simultánea de diferentes combinaciones de reactivos de anticuerpo. − Estrategias variables y frecuentemente subóptimas o inadecuadas para la identificación de la población (s) de células de interés, tales como la selección de CD45 en leucemias mieloblásticas agudas.

Como consecuencia, los paneles de anticuerpos aparentemente comparables no resultan en un diagnóstico comparable de muestras clínicas. De hecho, la reproducibilidad entre laboratorios de diagnóstico no es mayor que 70%. Desafortunadamente, los diagnósticos fallan debido a la distinción inapropiada entre células normales y malignas o la regeneración de la médula ósea se diagnostica erróneamente como recurrencia de la leucemia aguda.

En la patente deEstados Unidos núm. 5, 047, 321, Loken y Terstappen describen un procedimiento para el análisis multiparamétrico de componentes celulares en PB y BM. Con el procedimiento descrito, estos inventores podrían distinguir varios componentes celulares de PB y BM, contar el número de células dentro de cada componente, y proporcionar un análisis diferencial de cada uno de ellos basado en el uso combinado del colorante de ADN LDS-751 (excitón) , el colorante de ARN tiazol naranja (TO, Molecular Probes, Inc) , un anticuerpo monoclonal anti-CD45 marcado fluorescentemente, dispersión frontal de la luz (FSC) y dispersión lateral de la luz (SSC) . Este enfoque permite la identificación específica de las células rojas nucleadas, eritrocitos, reticulocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos y precursores de todas las células hematopoyéticas nucleadas. Sin embargo, el análisis multiparamétrico descrito no podría diferenciar específicamente

entre las células normales, reactivas, regeneradoras y neoplásicas que coexisten en la misma muestra, ni este procedimiento podría caracterizar adicionalmente estos grupos de células. Un perfeccionamiento adicional de esta patente se describió después en la patente de los Estados Unidos núm. 6, 287, 791 de Terstappen y Chen, pero ellos no demostraron ninguna mejora en la caracterización de diferentes poblaciones de leucocitos.

Más recientemente, Orfao y otros describieron en la patente de Estados Unidos núm. 7, 332, 295 un procedimiento para el análisis diferencial de leucocitos multidimensional de PB, BM y otros fluidos corporales, que permiten específicamente la identificación de células dendríticas y sus subconjuntos adicionalmente a las células rojas nucleadas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos y precursores hematopoyéticos de todas las células nucleadas. Además, en la patente de los Estados Unidos núm. 5, 538, 855, Orfao y otros describen un procedimiento que permite un análisis más detallado de los compartimentos linfoides a través de la identificación simultánea de hasta 12 subconjuntos diferentes de muestras de células T, B y NK en PB, BM y nódulos linfáticos. En la patente, Orfao y otros usaron una tinción combinada para los antígenos CD3, CD19, CD56 (y/o CD16) , CD4 y CD8 en una única tinción de 3 colores, donde se usaron pares de anticuerpos monoclonales conjugados con el mismo fluorocromo. Sin embargo, a través de este enfoque ni podrían caracterizar adicionalmente los subconjuntos de células identificadas ni distinguir entre las células normales y neoplásicas; además, algunos subconjuntos relevantes de células linfoides y no linfoides (por ejemplo, las células T-TCRy5+ ) presente en un PB, BM u otros tejidos y fluidos corporales normales, no se podrían detectar específicamente.

Ninguno de los procedimientos mencionados admiten directamente una caracterización más detallada de las células identificadas, que incluye la distinción entre las poblaciones de células normales, reactivas, regeneradoras, y neoplásicas/clonales. Tal caracterización y distinción requiere el uso de un mayor número de tinciones asociadas con emisiones de fluorescencia distinguibles y de instrumentos de citometría de flujo capaces de medir un mayor número de emisiones de fluorescencia diferentes.

Muchas otras publicaciones muestran que, basado en perfiles inmunofenotípicos específicos, las células normales se pueden distinguir a partir de sus homólogas neoplásicas, y que las capacidades de distinción (sensibilidad para distinguir células normales de clonales/malignas) aumentan con el número de reactivos... [Seguir leyendo]

1. Una composición reactiva para inmunofenotipado por citometría de flujo de leucocitos que comprende al menos ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes que comprende un conjunto de al menos tres 5 anticuerpos de identificación para la identificación de una población de leucocitos de interés y al menos cuatro anticuerpos de caracterización para una caracterización adicional y/o la clasificación de dicha población de leucocitos, en donde los anticuerpos están dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores:

CD20, CD4, CD45, CD19, IgA, CD8, IgK, CD56, CD5, TCRy5, CD3 y CD38, en donde el anticuerpo dentro 10 de los pares CD20/CD4, IgA/CD8 y CD19 /TCRy5 se conjuga al mismo fluorocromo, y en donde entre diferentes pares los fluorocromos son distinguibles.

2. Un conjunto de al menos dos composiciones reactivas, dicho conjunto que comprende una composición reactiva de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos una composición reactiva adicional que comprende 15 anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes dirigidos contra una de las siguientes combinaciones de marcadores:

(i) CD20, CD45, CD23, CD10, CD79b, CD19, CD200 y CD43

(ii) CD20, CD45, CD31, LAIR1, CD11c, CD19, IgM y CD81 20 (iii) CD20, CD45, CD103, CD95, CD22, CD19, CXCR5 y CD49d

(iv) CD20, CD45, CD62L, CD39, HLADR, CD19, CD27 y CD31

(v) CD4, CD45, CD7, CD26, CD3, CD2, CD28 y CD8

(vi) CD4, CD45, CD27, CCR7, CD3, CD45RO, CD45RA y CD8

(vii) CD4, CD45, CD5, CD25, CD3, HLADR, cyTCL1 y CD8 25 (viii) CD4, CD45, CD57, CD30, CD3, CD11c y CD8

(ix) CD4, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD16, CD94 y CD8

(x) CD4, CD45, CD279, CD3 y CD8

(xi) CD2, CD45, CD7, CD26, CD3, CD56, CD5 y CD19

(xii) CD16, CD45, CD57, CD25, CD3, CD56, CD11c y CD19 30 (xiii) HLADR, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD56, CD94 y CD19; o (xiv) CD45, CD138, CD38, CD28, CD27, CD19, CD117 y CD81

3. Composición reactiva o conjunto de composiciones reactivas de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde cada composición reactiva comprende anticuerpos conjugados con azul pacífico (PacB) u Horizon V450, 35 naranja pacífico (PacO) o AMCA, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o Alexa488, ficoeritrina (PE) , proteína clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) , PerCP o PE-TexasRed, ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7) , aloficocianina (APC) o Alexa647, y aloficocianina/H7 (APC-H7) , APC-Cy7, Alexa680 o Alexa700.

4º Conjunto de composiciones reactivas de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende al menos una 40 composición reactiva como se describe en el Tubo#1 de la Tabla 1 junto con al menos una composición reactiva como se describe en cualquiera de las Tabla.

2. 5.

5. Un kit diagnóstico para el inmunofenotipado por citometría de flujo de leucocitos que comprenden un conjunto de al menos dos composiciones reactivas de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, opcionalmente junto con 45 instrucciones para usar, tampón, y/o muestras de control.

6. Kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 5 para la identificación y caracterización de células linfoides maduras, que comprende un conjunto de composiciones reactivas mencionadas en la reivindicación 2 en el inciso (i) a (v) ; (vi) a (x) ; (xi) a (xiii) ; y/o (xiv) .

7. Un método para el inmunofenotipado por citometría de flujo de leucocitos, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica que comprende leucocitos;

(b) contactar una primera alícuota de dicha muestra con una primera composición reactiva de un conjunto 55 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y contactar al menos una segunda alícuota de dicha muestra con una composición reactiva adicional de dicho conjunto;

(c) analizar los leucocitos en dichas alícuotas en un citómetro de flujo; y

(d) almacenar y evaluar los datos obtenidos.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha muestra es sangre periférica, médula ósea, muestra de tejido tal como, nódulos linfáticos, adenoide, bazo, o hígado, u otro tipo de fluido corporal tal como fluido cerebroespinal, fluido vítreo, fluido sinovial, efusiones pleurales o ascitis.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la etapa (c) comprende-combinar la información inmunofenotípica de las poblaciones de células seleccionadas a partir de múltiples tubos de acuerdo con los llamados cálculos de vecinos más cercanos en los que las células individuales a partir de una alícuota de una muestra se comparan con las correspondientes células individuales a partir de otra alícuota de la misma muestra, de acuerdo con sus marcadores del esqueleto y el perfil de dispersión.