Métodos de producción de microesferas de amplificación de señal.

Un método de producir microesferas de proteína que comprende:

La mezcla de moléculas de proteína con un formador de matriz en una solución;

La adición de un reactivo reductor a la mezcla

La retirada del reagente de reducción, y

La retirada de la matriz dejando microesferas de moléculas de proteína;

En donde se selecciona el formador de la matriz de carbonato de calcio, de alginato de calcio, de sílice porosa y de oligo- o polisacárido.

Métodos de producción de microesferas de amplificación de señal.

La presente invención se refiere a los métodos de producción de microesferas de proteína que comprenden moléculas portadoras de la proteína. Estas microesferas de proteína son útiles en los ensayos biológicos in vitro para la detección de las especies objetivo en una muestra.

En la aplicación de las microesferas de proteína de la presente invención en el campo de los ensayos biológicos, las microesferas de proteína llevan en la superficie moléculas de afinidad para los reconocimientos específicos y vinculantes de moléculas objetivo en una muestra. Los ensayos biológicos tales como los inmunoensayos vinculados a enzimas (ELISA), los radioinmunoensayos (RIA), los ensayos de inmuno fluorescencia (FIA), los ensayos de inmuno aglutinación o los de ADN, ARN o los ensayos genómicos son bien conocidos y juegan un papel importante en la detección de los analltos en la investigación, en el ámbito de diagnóstico humano y veterinario, diagnosis forense, el análisis ambiental, el análisis alimentario y de detección para la defensa biológica de sustancias peligrosas en el aire o en el agua.

Los ensayos biológicos están basados en la interacción de por lo menos una blomolécula etiquetada con un anallto (objetivo) que se pretende sea detectado. La etiqueta es el medio para "visualizar" la interacción. Son conocidas diversas clases de etiquetas y ellas dan sus nombres a las diferentes técnicas mencionadas: las enzimas en los ELISA, los Isótopos del radio en los RIA, las fluoroforas en los FIA o las etiquetas específicas para las transferencias por adsorción (blots) Western, Southern o Northern. Otros tipos de etiqueta Incluyen los liposomas, las partículas látex en los ensayos de Inmuno aglutinación tales como los tintes, los mediadores, las partículas de oro.

Los requisitos más importantes para los ensayos biológicos son la especificidad analítica y la sensibilidad analítica. La especificidad analítica está determinada por las moléculas de afinidad o las moléculas de reconocimiento biológico, por ejemplo en el caso de acoplamiento del sitio de vinculación de un anticuerpo a su antígeno (analito) o la hibridación de dos filamentos complementarios de acido nucleico. La sensibilidad analítica de un bioensayo está también influida por las moléculas de reconocimiento biológico debido a la constante de afinidad de su biointeracción con las especies objetivo. La etiqueta actúa como un marcador que indica que una reacción ha sido llevada a cabo entre el objetivo y la molécula de afinidad y puede ser medida con diferentes técnicas:

(i) Ópticamente, por la medición de la absorción de un tinte o la luz fluorescente emitida por fluoroforas o la luz luminiscente emitida por compuestos luminiscentes o quimioluminescentes o la medición de la turbidez causada por la dispersión de la luz de las partículas látex aglutinadas;

(ii) Radiactivamente, por la medida de los radio ¡sotopos;

(¡II) Electroquímicamente por la medida de mediadores o sustancias electro activas; o

(iv) Magnéticamente por la medida de una fuerza magnética.

(v) Piezoeléctricamente por la medición de los cambios en la masa.

Los ensayo radio Inmunes, utilizando radio isótopos como etiquetas, son todavía considerados por muchos como el método más sensitivo. Esta técnica muy potente fue Introducida en 1959 por Yalow y Berson y representó una nueva era en la química analítica, en los diagnósticos y en medicina. Sin embargo, esta técnica tiene la desventaja que el riesgo de contaminación dañina de las personas y el medio ambiente no puede ser eliminado en su conjunto debido a los isotopos radioactivos utilizados.

Mientras tanto, han sido desarrollados y mejorados los métodos no-radiactivos con la intención de conseguir una sensibilidad analítica comparable. La importancia de los métodos ópticos basados en la fluorescencia, la luminiscencia y la absorción espectroscópica se ha fortalecido a lo largo del tiempo y continúa creciendo.

La tecnología ELISA utiliza enzimas como marcadores con la finalidad de amplificar la señal. Después de realizar el ensayo biológico, la biointeracción de analito y la sonda es amplificada mediante la producción de un elevado número de moléculas tinte por una molécula marcador de enzima. Las enzimas tales como la glucosa oxidasa (GOD, EC 1.1.3.4), la fosfatasa alcalina (AP, EC 3.1.3.1) o la peroxidasa (POD, EC 1.11.1.7) pueden ser utilizadas, con números de recambio de 2 moléculas sustrato por segundo (s'1), 5 s-1 y 1 s-1, respectivamente. Las desventajas de la técnica de la ELISA son el alto número de pasos involucrados en el procedimiento y el largo tiempo necesario para la incubación del sustrato.

Los métodos de fluorescencia han sido también empleados en los ensayos biológicos durante muchos años y continúan teniendo un alto interés. Todas las técnicas basadas en la fluorescencia aseguran una buena sensibilidad y un límite de detección bajo de 1'8 a 1'18 M. Las técnicas especiales, por ejemplo, el "tiempo de fluorescencia resuelta", las técnicas de quimio - y bioluminiscencia o las técnicas basadas en la transferencia de energía entre una molécula donante y una receptora pueden alcanzar los límites de detección de 1'151'18 M.

Los ensayos de inmunofluorescencia conocidos en la Técnica anterior utilizan etiquetas fluorescentes de bajo peso molecular con grupos de enlace funcionales reactivos (SOUTHWICKP. L., et al., Cytometry, 11, págs. 418-43,

199, MUJUMDAR, R.B., et al., Bioconjugate Chemistry, 4, págs. 15-111, 1993, MUJUMDAR, R. B., et al., Cytometry, 1, pp. 11-19,1989), partículas coloreadas por tinte y las fluorescentes (US Patent nos. US 4.837.168 y U.S. 6.13.531 y solicitud de patente Internacional núm. WO 95/8772) o los dendrímeros punzantes fluoróforos (DE 718 3 197).

También es conocido emplear los llposomas cargado-marcados para la amplificación de la señal en los ensayos inmunológlcos (US Patent nos. US 5.756.362, U.S. 4.874.71 y US 4.73.17). En la práctica, la sensibilidad de estos métodos está limitada por la cantidad de sustancia marcadora que puede ser Incorporada en los liposomas en forma solublllzada. Un inconveniente adicional de la utilización de liposomas etiquetados es la limitada estabilidad de los liposomas.

Como se mencionó más arriba, es Importante conseguir una muy alta sensibilidad analítica en el desarrollo de los ensayos biológicos, definida como el grado de respuesta de la señal para un cierto cambio en la concentración de analto (la pendiente de la curva de calibración). En las determinaciones ¡nmunoqufmlcas, Indiferentemente de si son tipos de ensayos competitivos o sandwich, la sensibilidad analítica es dependiente del rango de concentración.

Otros dos factores que afectan en la sensibilidad analítica son la cantidad de muestra necesaria para la determinación y el tiempo total de reacción para el resultado. Cuanto mayor sea el volumen de la muestra y cuanto más largo el tiempo total aplicado a la reacción, menor será la concentración de analto que puede ser detectada y medida. Sin embargo, en muchas situaciones prácticas, no hay suficiente volumen de muestra disponible (por ejemplo, en la Investigación farmacéutica) o el componente está distribuido en un volumen muy grande de muestra (por ejemplo, en los residuos de antibióticos en la leche o en una sustancia blodefensiva en el aire. Por lo tanto, un desafío clave es detectar o determinar cantidades muy pequeñas de sustancias en los volúmenes pequeños disponibles de muestra o detectar y / o determinar una sustancia distribuida en muy baja concentración en un volumen de muestra grande.

En consecuencia, la tecnología aplicada debe tener alta sensibilidad analítica, especialmente en los rangos muy bajos de concentración.

Con el fin de que puedan ser comparadas las sensibilidades analíticas de las diversas técnicas conocidas de manera objetiva, en rangos de concentración muy bajos, el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Instltute y/o el NCCLS en los Estados Unidos) han definido la sensibilidad analítica con tres términos: Límite de Blank (LoB), Límite de detección (LoD) y Límite de Quantitation (Cuantificación) (LoQ). Los datos de estos parámetros son estimados y utilizados para las comparaciones entre las varias tecnologías.

Con el fin de conseguir altas sensibilidades analíticas, han sido desarrollados para efectuar la amplificación de la señal diferentes sistemas de bioetiquetado, tales como las bloetlquetas enzimas, bioetiquetas de micro cristal orgánicas y las etiquetas de oro coloidal, etc.

En los sistemas de bioetiqueta de enzima, las moléculas enzlmáticas... [Seguir leyendo]

1. Un método de producir microesferas de proteína que comprende:

La mezcla de moléculas de proteína con un formador de matriz en una solución;

La adición de un reactivo reductor a la mezcla La retirada del reagente de reducción, y

La retirada de la matriz dejando microesferas de moléculas de proteína;

En donde se selecciona el formador de la matriz de carbonato de calcio, de alginato de calcio, de sílice porosa y de oligo- o polisacárido.

2. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1 en donde la matriz es retirada por medios físicos seleccionados de tratamiento por alta temperatura o cambio de pH.

3. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1 en donde el paso de retirada de la matriz incluye la adición de un agente para la retirada de la matriz seleccionado de un agente quelante, EDTA, un ácido o una base.

4. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el reactivo de reducción es ditiotreitol (DTT).

5. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1 en donde el formador de matriz es el carbonato de calcio formado por adición de una solución de carbonato de sodio a una mezcla de proteína y cloruro de calcio en una solución.

6. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde dichas moléculas de proteína son moléculas de afinidad por vinculación a un objetivo en solución.

7. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde dicha proteína es una proteína portadora y en donde dicho método comprende además la vinculación de las moléculas precursoras de señal a dicha proteína portadora.

8. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 7 en donde se selecciona la proteína portadora de proteínas fibrosas, de proteínas citoesqueletales o de proteínas de matriz extracelular; o de proteínas globulares, de proteínas de la sangre, de hemoproteínas, de proteínas de adhesión celular o de proteínas de transporte, de factores de crecimiento, de proteínas receptoras, de proteínas de vinculación a ADN, de proteínas del sistema inmunitario, de anticuerpos mono- o policlonales, de proteínas de almacenamiento/transporte nutrientes, de proteínas chaperonas o enzimas; o de proteínas genéticamente modificadas; o de proteínas recombinantes o de proteínas químicamente modificadas, y de proteínas sintéticas.

9. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 8 en donde dicha protema portadora es albúmina de suero bovino.

1. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en donde las moléculas precursoras de señal son sustancias de bajo peso molecular seleccionadas del grupo consistente de

(i) fluoróforos seleccionado del grupo consistente de fluoresceínas, cianinas, carbocianinas, rodaminas, xantenos, sustancias fluorescentes basadas en diazo tinte y moléculas pequeñas fluorescentes aromáticas y heteroaromáticas;

(¡i) luminóforos y sus derivados;

(i¡¡) cromóforos seleccionados del grupo consistente de la cianina, pirazolona, antraquinona, carbocianina, rodamina, xanteno, carotinoide y diazo- y monoazo, oxazina, añil, o sustancias de tinte basadas en la riboflavina;

(iv) sustratos enzimáticos;

(v) grupos prostéticos, o

(vi) sustancias redox activas seleccionadas de mediadores redox, sustancias activas por electrodo; o sustancias de alto peso molecular seleccionadas del grupo que consiste en:

(vii) las enzimas y sus precursores;

(viii) proteínas bioluminogénicas y fluorogénicas;

(ix) ácidos nucleicos;

(x) ribozimas y

(x¡) aptámeros.

11. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1 en donde las moléculas precursoras de señal son fluoróforos seleccionados de fluoresceína diacetato (FDA), de fluoresceína diacetateisotiocianato (FDA-isotiocianato) y de fluoresceína maleimida (FDA-maleimida).

12. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 que además comprende el paso de la vinculación de las moléculas de afinidad a la superficie de la microesferas.

13. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 12 que comprende la conjugación o enlace de las moléculas de afinidad a las microesferas vía moléculas del vinculador seleccionadas del grupo consistente de la avidina, estreptavidlna, avidina desglicosilada, proteína A, proteína G, lectina o vinculadores transversales de bajo peso molecular.

14. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 6, la reivindicación 12 o la reivindicación 13 en donde las moléculas de afinidad son moléculas de bioreconocimiento.

15. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 14 donde se seleccionan las moléculas de afinidad del grupo que consiste de:

(i) Los péptidos y proteínas seleccionadas del grupo consistente de anticuerpos incluyendo los anticuerpos monoclonales y los policlonales, los receptores, los antígenos, las proteínas recombinantes, las lectinas, las avidinas, los oligopéptidos, las lipoprotefnas, las glicoprotefnas, las hormonas peptídicas y los alérgenos o partes de los mismos;

(¡i) Los ácidos nucleicos seleccionados del grupo consistente de ADN, ARN, los oligonucleótidos, las ribozimas, los aptámeros y partes de los mismos;

(i¡¡) Los carbohidratos seleccionados del grupo consistente de los mono-, oligo- y polisacáridos, los glicolípidos, los proteo-polisacáridos y partes de los mismos;

(iv) Los ligandos con bajo peso molecular seleccionados de la biotina o derivados de la biotina, los esteroides, las hormonas, los cofactores o las coenzimas, los activadores, los inhibidores, los pseudosustratos o los grupos prostéticos de las enzimas, los fármacos, los alérgenos o los haptenos, y

(v) polímeros impresos moleculares (MIPs) o mezclas de los mismos.