Método para ensayos de aglutinación serológica realizados en una muestra líquida de película fina.

Un método para realizar un ensayo de aglutinación serológica para uno o más anticuerpos analito objetivo (106) en una muestra líquida (105),

y dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una cámara plana fina (1) que tiene superficies planas opuestas (101), al menos una de las cuales es transparente;

b) colocar una cantidad de primeras partículas detectables (102) en dicha cámara plana (1), y dichas primeras partículas (102) contienen, en sus superficies, un antígeno (103) contra el que se dirigen los anticuerpos analito objetivo (106);

c) colocar segundas partículas de control (115), similares en tamaño y forma a dichas primeras partículas (102), en dicha cámara (1), y dichas partículas de control (115) difieren de dichas primeras partículas (102) en 10 el color o la fluorescencia u otras características distinguibles, y dichas partículas de control (115) están desprovistas de dichos antígenos (103);

d) permitir o provocar que dichas primeras partículas detectables (102) y dicha muestra (105) se mezclen entre sí, por lo que dichos anticuerpos analito objetivo (106), cuando están presentes, provocarán la aglutinación de dichas primeras partículas (102);

e) formar una imagen o escanear electrónicamente dicha mezcla para detectar agregados individuales de partículas mediante el análisis de patrones de intensidad de píxeles que resultan de la agregación de las partículas detectadas; y

f) determinar la presencia o ausencia de aglutinación significativa de partículas comparando las señales de las primeras partículas agregadas (107, 108) con las señales de las partículas de control agregadas.

Método para ensayos de aglutinación serológica realizados en una muestra líquida de película fina Antecedentes de la invención

1. Campo Técnico

Esta descripción se refiere a un método y sistema para realizar un ensayo de aglutinación serológica en una muestra líquida. El sistema proporciona un método simple para crear una mezcla muestra/reactivo in situ dentro de una cámara de análisis de muestras sin el uso de ningún componente de manipulación de fluidos de precisión. Las concentraciones relativas y absolutas de los reactivos se pueden determinar en cualquier área pequeña del recipiente de reacción.

2. Información de Antecedentes

En la mayoría de los ensayos es necesario proporcionar una dilución exacta de la muestra a analizar para que la concentración del analito se pueda llevar al intervalo útil del ensayo, y debido a que esta dilución afecta a la concentración del analito, la precisión y exactitud del ensayo dependen en gran medida de la precisión y exactitud de la dilución. Una razón para esta dilución es que los inmunoensayos se ven afectados por un fenómeno conocido como el efecto prozona. El término "prozona", tal como se usa en esta descripción, se referirá a las condiciones de exceso de anticuerpos en las que generalmente en los inmunoensayos basados en precipitación o aglutinación se inhiben o impiden las reacciones, la postzona, en la que las condiciones de exceso de antígenos en un inmunoensayo inhiben las reacciones de aglutinación o precipitación, y el "efecto gancho", en el que las condiciones de exceso de antígenos provocan resultados falsamente bajos. Las condiciones en las que se dan los efectos prozona pueden provocar resultados falsos negativos y falsamente bajos, con resultados catastróficos para el paciente.

Cada combinación de ensayos tiene un intervalo de trabajo definido empíricamente, y los ensayos se deben realizar con muestras y reactivos en las diluciones adecuadas. Este tipo de dilución se ha realizado tradicionalmente por medio del uso de componentes de manipulación de fluidos de precisión o de la repetición manual del ensayo a diluciones mayores del anticuerpo para ver si el negativo es un verdadero negativo. Aunque estas pueden ser muy exactas, requieren una calibración cuidadosa y añaden una gran complejidad a la instrumentación automatizada. Además, el intervalo de analito presente en la muestra puede superar el intervalo dinámico del ensayo y puede requerir la dilución adicional de la muestra para obtener resultados exactos. Además, la técnica anterior requiere muchas cámaras para contener las diversas concentraciones de reactivos.

Los ensayos serológicos, tales como para los anticuerpos hacia patógenos de enfermedades infecciosas, son importantes ya que indican la inmunidad existente debida a la inmunización o a la exposición previa o actual, dependiendo de la clase de inmunoglobulina presente, hacia el agente infeccioso. De forma similar, se pueden usar para detectar la autoinmunidad, y similares. Existen varios tipos de ensayos realizados, que incluyen la aglutinación, fijación del complemento, precipitación, etc. Una característica casi universal de tales ensayos es la necesidad de diluir la muestra un cierto número de veces para detectar el punto en el que los anticuerpos ya no son eficaces para provocar un ensayo positivo. Esto se denomina "título", que es la dilución más elevada del suero o plasma del paciente que produce una aglutinación detectable o una reacción medida con el antígeno de ensayo. Esto requiere, de hecho, la ejecución de muchos ensayos distintos en cámaras distintas para llegar al resultado. Otro problema de tales ensayos es que los puntos finales a veces son difíciles de determinar, lo que añade un error significativo a la determinación del título. La automatización puede incrementar la eficacia y la exactitud del ensayo, pero realizar las diluciones mediante un instrumento es muy difícil y consume tiempo, lo que incluye la necesidad de definir primero la dilución deseada, que puede variar de ensayo a ensayo, y las múltiples etapas de dilución son muy complejas.

El documento US-4197088 describe un método para la determinación cualitativa y cuantitativa de reacciones inmunológicas. El documento EP-0366151 describe un método y aparato para un inmunoensayo fotoacústico. El documento WO-02/23154 describe ensayos basados en la agregación. El documento EP-1365240 describe métodos, aparatos, y reactivos para inmunoensayos. El documento US-5270166 describe inmunoensayos que emplean anticuerpos anti-hapteno genéricos y materiales para el uso en ellos.

Seria deseable proporcionar un método y aparato para medir títulos de anticuerpos en un sistema automatizado que no requiera múltiples diluciones y que elimine el riesgo de falsos negativos debido al efecto prozona.

Sumario de la invención La presente invención proporciona métodos para realizar un ensayo de aglutinación serológica, según las reivindicaciones 1 y 6.

Se puede usar un marcador sensible para permitir la medida de la concentración de los reactivos añadidos a la cámara in vitro en el área de la reacción a analizar. Un marcador sensible en esta descripción significa un colorante o substancia detectable que no interfiere con la reacción a analizar y que se difunde a una velocidad cercana a la de los reactivos a los que se añade. Los marcadores sensibles pueden ser un colorante o colorantes que se pueden medir por medios ópticos tales como absorción o emisión fluorescente. El marcador sensible está presente de manera homogénea, en disolución o en suspensión coloidal, con al menos uno de dos o más líquidos que se van a añadir posteriormente, y que se van a dejar mezclar, en la cámara de análisis fina que se usa.

La altura de la cámara puede ser menor de 100 micras (100 μm) , y preferiblemente menor de 20 micras (20 μm) , y las dimensiones laterales de la cámara son preferiblemente de varios centímetros, la diferencia mayor de 1.000 veces en las dimensiones vertical y horizontal dará como resultado que se alcance el equilibrio en la dimensión vertical de manera extremadamente rápida, mientras el equilibrio en la dimensión lateral necesitará cientos a miles de veces más. Si se analiza la imagen completa de la cámara de reacción tomada o escaneada y las áreas pequeñas discretas de la imagen o escaneo, donde las caras laterales de las áreas de análisis discretas están en el intervalo de 1 a 3 veces la altura de la cámara, el volumen que se está sometiendo al análisis estará en un equilibrio aproximado. Las áreas tomadas a distancias de milímetros o más, laterales respecto de la primera área, tendrán diferentes condiciones de equilibrio. La señal del marcador sensible mezclado se mide antes y después de la mezcla o difusión posterior con los reactivos adicionales, para permitir el cálculo de la concentración final de marcador sensible medido que refleja la dilución relativa de los componentes. En los casos en los que hay presentes más de dos líquidos en una cámara, se puede emplear más de un marcador sensible que se pueda distinguir de los otros marcadores sensibles, y cada uno se añade a uno de los componentes añadidos, para permitir el cálculo de las proporciones relativas de cada uno de los componentes. Si se conoce la concentración inicial de los constituyentes de los componentes, se pueden usar las concentraciones relativas para calcular la concentración absoluta de los componentes añadidos en masa por unidad de volumen. Así, las concentraciones relativas de los reactivos añadidos en cualquier área analizada pequeña se pueden tratar como un recipiente o cámara de reacción discreta virtual cuyas concentraciones de reactivos añadidos son calculables, y los resultados de la unión respecto de la ausencia de unión o aglutinación u otra señal empleada en el inmunoensayo que se está realizando se pueden medir y representar gráficamente como la señal obtenida por dilución calculada de muestra o patrón por concentración de anticuerpo añadido o antígeno añadido.

Por lo tanto, un objetivo de esta invención es proporcionar un método en el que se usa la mezcla y la difusión para crear un gradiente de concentración entre dos o más líquidos miscibles en una muestra de película fina en una cámara de forma que el equilibrio en la dimensión fina de la cámara es muy rápido, y las diferencias de concentración en el eje longitudinal de la cámara no alcanzan el equilibrio durante el tiempo del ensayo, y la interdilución relativa final se mide mediante la concentración relativa de un marcador sensible que no participa en ninguna de las reacciones químicas deseadas y cuyas propiedades son tales que permiten la medida exacta en cualquier... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar un ensayo de aglutinación serológica para uno o más anticuerpos analito objetivo (106) en una muestra líquida (105) , y dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una cámara plana fina (1) que tiene superficies planas opuestas (101) , al menos una de las 5 cuales es transparente;

b) colocar una cantidad de primeras partículas detectables (102) en dicha cámara plana (1) , y dichas primeras partículas (102) contienen, en sus superficies, un antígeno (103) contra el que se dirigen los anticuerpos analito objetivo (106) ;

c) colocar segundas partículas de control (115) , similares en tamaño y forma a dichas primeras partículas (102) , en dicha cámara (1) , y dichas partículas de control (115) difieren de dichas primeras partículas (102) en el color o la fluorescencia u otras características distinguibles, y dichas partículas de control (115) están desprovistas de dichos antígenos (103) ;

d) permitir o provocar que dichas primeras partículas detectables (102) y dicha muestra (105) se mezclen entre sí, por lo que dichos anticuerpos analito objetivo (106) , cuando están presentes, provocarán la aglutinación de dichas primeras partículas (102) ;

e) formar una imagen o escanear electrónicamente dicha mezcla para detectar agregados individuales de partículas mediante el análisis de patrones de intensidad de píxeles que resultan de la agregación de las partículas detectadas; y

f) determinar la presencia o ausencia de aglutinación significativa de partículas comparando las señales de las 20 primeras partículas agregadas (107, 108) con las señales de las partículas de control agregadas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la presencia de aglutinación de partículas se realiza midiendo las áreas de píxeles de las primeras partículas aglutinadas (107, 108) con las áreas de píxeles que contienen las partículas de control aglutinadas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la aglutinación de partículas se realiza determinando 25 el porcentaje de partículas de cualquier tipo dado que están agregadas o agrupadas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que hay más de una clase de primeras partículas detectables distinguibles por separado, y cada clase contiene antígenos diferentes de forma que se pueden realizar múltiples ensayos simultáneamente en la misma cámara de muestra (1) .

5. El método de la reivindicación 1, en el que dichas primeras partículas (102) y dichas partículas de control (115) 30 están marcadas de manera diferencial para ser distinguibles entre sí.

6. Un método para realizar un ensayo de aglutinación serológica para uno o más antígenos analito objetivo en una muestra líquida (105) , y dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una cámara plana fina (1) que tiene superficies planas opuestas (101) , al menos una de las cuales es transparente;

b) colocar una cantidad de primeras partículas detectables (102) en dicha cámara plana (1) , y dichas primeras partículas (102) contienen en sus superficies un ligando dirigido contra los antígenos analito objetivo que pueden estar presentes en la muestra;

c) colocar segundas partículas de control (115) , similares en tamaño y forma a dichas primeras partículas (102) , en dicha cámara (1) , y dichas partículas de control (115) difieren de dichas primeras partículas (102) en el color o la fluorescencia u otras características distinguibles, y dichas partículas de control (115) están desprovistas de dichos ligandos;

d) permitir o provocar que dichas primeras partículas detectables (102) y dicha muestra (106) se mezclen entre sí, por lo que dichos antígenos analito objetivo, cuando están presentes, provocarán la aglutinación de dichas primeras partículas (102) ;

e) formar una imagen o escanear electrónicamente dicha mezcla para detectar agregados individuales de partículas mediante el análisis de patrones de intensidad de píxeles que resultan de la agregación de las partículas detectadas; y

f) determinar la presencia o ausencia de aglutinación significativa de partículas comparando las señales de las primeras partículas agregadas (107, 108) con las señales de las partículas de control agregadas.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la detección de la presencia de aglutinación de partículas se realiza midiendo las áreas de píxeles que contienen las primeras partículas aglutinadas (107, 108) con las áreas de píxeles que contienen las partículas de control aglutinadas.

8. El método de la reivindicación 6, en el que la detección de la aglutinación de partículas se realiza determinando el porcentaje de partículas de cualquier tipo dado que están agregadas o agrupadas.

9. El método de la reivindicación 6, en el que hay más de una clase de primeras partículas detectables distinguibles por separado, y cada clase contiene ligandos diferentes de forma que se pueden realizar múltiples ensayos simultáneamente en la misma cámara de muestra.

10. El método de la reivindicación 6, en el que dichas primeras partículas (102) y dichas partículas de control (115) están marcadas de manera diferencial para ser distinguibles entre sí.