Identificación de resistencia a antibióticos usando antibióticos marcados.

Método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica,

que comprende las etapas:

(a) proporcionar un antibiótico marcado,

(b) poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo,

(c) detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra biológica, y

(d) determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente,

en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

Identificación de resistencia a antibióticos usando antibióticos marcados

El objeto de la presente invención es un método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo.

La caracterización de microorganismos en procedimientos de diagnóstico rutinarios engloba la determinación de la identidad de una especie y su sensibilidad frente a antibióticos. Con el fin de conseguir esto, es necesario tomar los microorganismos de su entorno y enriquecerlos en un entorno selectivo para la identificación separada (ID) y ensayo de sensibilidad a antibióticos (AST). Actualmente, la AST/ID de microorganismos se consigue identificando la presencia o ausencia de una matriz de características bioquímicas y la capacidad (o incapacidad) de crecer en presencia de antibióticos. Alternativamente, puede extraerse el ADN de una muestra y entonces se ensaya el ADN combinado para la presencia/ausencia de secuencias específicas utilizando técnicas de amplificación génica. Esto puede señalar la presencia de un organismo en la muestra. Igualmente, puede detectarse en la muestra la presencia de un gen que codifica resistencia a antibióticos. Por definición, la extracción de ADN directamente de una muestra da lugar a ADN combinado a partir de una mezcla desconocida de células. Sólo se pueden conseguir resultados inequívocos si el ADN se extrae de una colonia pura.

Staphylococcus aureus es una de las causas más comunes de infecciones nosocomiales o comunitarias, que dan lugar a enfermedades graves con altas proporciones de morbilidad y mortalidad. En los últimos años, el incremento en el número de cepas bacterianas que muestran resistencia a Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se ha convertido en un problema clínico y epidemiológico grave porque este antibiótico (o análogo) se considera la primera opción en el tratamiento de infecciones por staphylococci. La resistencia a este antibiótico implica resistencia a todos los antibióticos U-lactama. Por estas razones, tiene una importancia clave la exactitud y prontitud en la detección de resistencia a meticilina para asegurar un tratamiento con antibiótico correcto en pacientes infectados así como para controlar aislados de MRSA en entornos hospitalarios, para evitar su diseminación.

Las cepas de MRSA portan el gen mecA, que codifica una proteína PBP2 modificada (PBP21 o PBP2a) con baja afinidad para meticilina y todos los antibióticos U-lactama. La expresión fenotípica de resistencia a meticilina puede alterarse dependiendo de las condiciones de crecimiento para S. aureus, tales como temperatura u osmolaridad del medio, y esto puede afectar la exactitud de los métodos usados para detectar resistencia a meticilina (1). Las cepas bacterianas hetero-resistentes pueden evolucionar a cepas totalmente resistentes y, por lo tanto, pueden seleccionarse en aquellos pacientes que reciben antibióticos U-lactama, causando así un fracaso terapéutico. Desde un punto de vista clínico, deberían considerarse, por lo tanto, completamente resistentes.

Existen varios métodos para detectar resistencia a meticilina (1,9) incluyendo métodos clásicos para determinar una concentración inhibidora mínima MIC (difusión en disco, Etest, o dilución de caldo), técnicas de cribado con medio de cultivo sólido que contiene oxacilina, y métodos que detectan el gen mecA o su producto proteico (proteína PBP2') (3,4). La detección del gen mecA se considera como el método de referencia para determinar resistencia a meticilina (1). Sin embargo, muchos laboratorios a lo largo del mundo no tienen los fondos requeridos, la capacidad o el personal experimentado requerido para proporcionar ensayos moleculares para detectar aislados de MRSA. Por lo tanto, es esencial, que se incorporen otros métodos de cribado, más útiles, en la práctica clínica rutinaria. Además, la presencia de resistencia a antibióticos tiene su relevancia a varios niveles, todos los cuales tienen significancia clínica

1. Presencia de un gen que confiere resistencia, tal como mecA, mef(E),

2. Presencia de un gen represor que inhibe la expresión fenotípica de dicho mecanismo de resistencia, por ejemplo, represor MecA

3. Mecanismos de resistencia múltiples; por ejemplo, resistencia a Macrólidos mediante la modificación del sitio de unión ribosomal y presencia de mecanismo(s) de eflujo.

4. Nivel de expresión de dicho mecanismo de resistencia regulado a través de la transcripción y traducción detectable como el fenotipo

Las técnicas de cultivo actuales requieren el aislamiento de una colonia discreta y la identificación posterior y ensayo de resistencia, asumiendo que una única colonia deriva de una única célula y, por lo tanto, se considera pura. En la realidad, sin embargo, la generación de una colonia pura a partir de una muestra clínica, en la que los patógenos viven frecuentemente en comunidades de bio-película, no puede garantizarse. Igualmente, usando tecnologías de amplificación, se extraen y se amplifican secuencias de ácido nucleico de múltiples células y, por lo tanto, pueden dar lugar a resultados positivos falsos. Sólo si la identificación y resistencia pueden llevarse a cabo y leerse en células individuales, es posible una visión verdadera del patógeno invasor.

Un amplio rango de antibióticos porta un grupo amino primario. Es muy conocido en la técnica que reactivos tales como Isotiocianato de fluoresceína (FITC), Fluoresceína-éster de N-hidroxisuccinimida reaccionarán fácilmente con dichas aminas primarias.

La diseminación creciente de resistencia a antibióticos tanto en sistemas comunitarios como sanitarios necesita la precisión y velocidad de la biología molecular. Sin embargo, la complejidad y coste de estos ensayos prohíbe la aplicación generalizada en un entorno de ensayo rutinario.

Teniendo en cuenta las dificultades en la identificación de un microorganismo y su resistencia potencial frente a un antibiótico en una muestra biológica, es deseable poder identificar rápidamente un patógeno directamente a partir de una muestra sin cultivo ni amplificación y, además, poder detectar o excluir la presencia de resistencia frente a un antibiótico elegido.

Es la intención de esta invención proporcionar una solución permitiendo de manera simultánea la identificación y ensayo de resistencia a nivel celular. Esto reduce la complejidad de los ensayos de manera que puede hacerse una asignación inequívoca de un fenotipo para células individuales. Los ensayos se diseñan para reducir el tiempo de manejo y de obtención de resultados para permitir programas de cribado tales como el cribado de todos los pacientes entrantes por ejemplo para MRSA.

Un primer objeto de la presente invención es así un método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica, que comprende las etapas:

(a) proporcionar un antibiótico marcado,

(b) poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo,

(c) detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra

biológica, y

(d) determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente,

en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

El principio subyacente del método es que si un organismo es sensible o resistente a un antibiótico, se diferenciará claramente de su equivalente resistente o sensible. Los antibióticos pueden unirse a sus sitios de unión respectivos bien en el lumen celular, citoplasma, la pared celular o a proteínas secretadas tales como beta-lactamasas. Dependiendo del mecanismo de resistencia, los organismos resistentes pueden mostrar en la mayor parte de los casos bien afinidad reducida o ausencia de afinidad para el antibiótico debido a una afinidad reducida, por ejemplo, para ribosomas o proteínas de unión a penicilina. A la inversa, si el mecanismo de resistencia se debe a la ab/adsorción a la membrana celular externa, el organismo resistente presentará una fluorescencia muy aumentada.

La muestra biológica puede ser cualquier muestra de origen biológico, tal como una muestra clínica o alimentaria, que se sospecha que comprende un microorganismo resistente a antibiótico. El microorganismo puede seleccionarse... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica, que comprende las etapas:

(a) proporcionar un antibiótico marcado,

(b) poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo,

(c) detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra biológica, y

(d) determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente,

en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en aminoglicósidos, carbacefemos, carbapenemos, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, monobactamas, antibióticos beta-lactama, quinolonas, bacitracina, sulfonamidas, tetraciclinas, estreptograminas, cloranfenicol, clindamicina, y lincosamida.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el antibiótico se marca con un grupo marcador luminiscente, en particular con un grupo marcador fluorescente.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sitio de unión está localizado en el lumen celular, en el citoplasma, en la pared celular, o/y en una proteína secretada.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiótico es un antibiótico beta- lactama, que se une preferiblemente a la proteína de unión PBP2 y no a PBP2a.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador en la etapa (c) se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo por láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo particular se identifica con un ácido nucleico marcado capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico en el microorganismo en condiciones in-situ.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el microorganismo particular se identifica por FISH.

9. El método según la reivindicación 7 u 8, en el que el microorganismo se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo por láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

1. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos, en particular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo es una bacteria Gram positiva que se perfora por la formulación Tampón de Perforación de Gram Positivas en la Tabla 2, o en el que el microorganismo es una levadura u hongo, que se perfora por la formulación Tampón de Perforación de Levaduras en la Tabla 2.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un método de diagnóstico.