Haptenos, conjugados de haptenos, composiciones de los mismos y método para su preparación y uso.

Un método para detectar dos o más dianas diferentes en una muestra,

que consiste en lo siguiente:

poner en contacto la muestra con dos o más fracciones de unión específica que se unen específicamente a dos o más dianas diferentes, donde las dos o más fracciones de unión específica se conjugan con diferentes haptenos, siendo al menos uno de los haptenos una primera isoxazolina de rotenona con la fórmula

donde R-R5 son, independientemente, hidrógeno, aldehído, alcoxi, alifático, alifático sustituido, heteroalifático, amino, aminoácido, amido, ciano (-CN), halógeno, hidroxilo, hidroxilamina, oxima, éter de oxima, alquil hidroxil, cetona, nitro, sulfhidrilo, sulfonilo, sulfóxido, carboxilo, carboxilato, éster, éster de alquilo, acilo, exometileno, éter, cíclico, heterocíclico, arilo, alquil arilo, heteroarilo, carbohidrato, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos; Y es oxígeno, una amina o azufre; y al menos uno de los sustituyentes R-R5 está unido a un conector o a una molécula vehículo, siendo el otro hapteno un oxazol, un pirazol, un tiazol, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un nitroarilo distinto de dinitrofenilo, una segunda isoxazolina de rotenona distinta de la primera isoxazolina de rotenona, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiacepina;

poner en contacto la muestra con dos o más anticuerpos anti-hapteno diferentes que se pueden detectar por separado; y

detectar los anticuerpos anti-hapteno.

Haptenos, conjugados de haptenos, composiciones de los mismos y método para su preparación y uso Campo de la invención La presente divulgación se refiere a haptenos, conjugados de haptenos y composiciones de los mismos utilizados con fines terapéuticos y de diagnóstico. Más concretamente, esta divulgación se refiere a haptenos, conjugados de haptenos y conjugados de anticuerpos anti-haptenos, que se pueden utilizar en diversas combinaciones para la identificación, visualización y/o cuantificación simultáneas de una pluralidad de dianas en una muestra, tales como múltiples dianas de ácido nucleico y proteína en una muestra de tejido.

Antecedentes Por lo general, solamente las moléculas de gran tamaño, los agentes infecciosos y los objetos extraños insolubles pueden provocar una respuesta inmune en un animal. Sin embargo, en determinados casos se puede provocar que los haptenos, que son moléculas pequeñas, provoquen una respuesta inmune, si primero se unen a un vehículo de gran tamaño (como una proteína) para formar un inmunógeno. Los haptenos, en combinación con anticuerpos antihaptenos que se activan contra los inmunógenos y se aislan, son útiles para detectar dianas moleculares concretas. Por ejemplo, se pueden etiquetar fracciones de unión específica, como anticuerpos primarios y sondas de ácido nucleico, con una o más moléculas de hapteno, y una vez que estas fracciones de unión específica están unidas a sus dianas moleculares se pueden detectar utilizando un conjugado de anticuerpo anti-apteno que incluye una etiqueta detectable como una enzima o una etiqueta fluorescente. La unión del conjugado de anticuerpo antihapteno detectable en una muestra indica la presencia de la diana en la misma.

La digoxigenina, presente exclusivamente en plantas Digitalis como un metabolito secundario, es un ejemplo de hapteno que se ha utilizado en diversos ensayos moleculares. La Patente estadounidense nº 4.469.797, titulada "Digoxigenin Immunogens, Antibodies, Label Conjugates and Related Derivatives, " divulga el uso de inmunoensayos para determinar las concentraciones de digoxina en muestras de sangre, basándose en la unión específica de los anticuerpos anti-digoxina al fármaco en la muestra de ensayo. La Patente estadounidense nº 5.198.537, titulada "Digoxigenin Derivatives and Use Thereof, " describe una serie de derivados de digoxigenina adicionales que han sido utilizados en ensayos inmunológicos, tales como inmunoensayos.

Otros haptenos se han desarrollado para procedimientos analíticos, entre los que se incluyen la biotina y la fluoresceína. No obstante, cada uno de estos haptenos presenta inconvenientes específicos que han convertido a la dioxigenina en el hapteno preferido para los inmunoensayos sensibles. En el caso de la biotina, determinadas muestras biológicas incluyen biotina endógena, lo que puede provocar una interferencia de fondo. De igual modo, la fluoresceína, una molécula fluorescente, puede provocar fluorescencia de fondo en un inmunoensayo fluorescente. Para los ensayos in situ, como los ensayos inmunohistoquímicos (IHC) y los ensayos de hibridación in situ (ISH) de muestras de tejido y citológicas, especialmente los ensayos multiplexados de estas muestras, resulta sumamente recomendable identificar y desarrollar nuevos haptenos y anticuerpos anti-haptenos (y conjugados de los mismos) para proporcionar una mayor flexibilidad al ensayo, especialmente dado que ahora resulta evidente que las muestras se pueden caracterizar mejor mediante la detección simultánea de múltiples dianas.

Un objetivo fundamental de la terapia del cáncer consiste en destruir de forma selectiva las células malignas, o inhibir su crecimiento incontrolado, aunque sin afectar negativamente a las células normales. Los fármacos quimioterapéuticos tradicionales son altamente citotóxicos y, a pesar de que preferiblemente tienen una mayor afinidad por las células malignas que por las células normales, por lo general tienen un efecto negativo sobre estas últimas. En la actualidad se están desarrollando nuevos agentes terapéuticos dirigidos a las vías de los nutrientes y del factor de crecimiento que regulan el crecimiento celular y el metabolismo en respuesta a estímulos intracelulares y ambientales. Estas vías de señalización a menudo se encuentran alteradas o desreguladas en el cáncer. Por ejemplo, determinados factores de crecimiento (como el EGF, un factor de crecimiento que desencadena la actividad de la proteína-receptor de tirosina quinasa (RTK) para iniciar una cascada de transducción de señales que provoca cambios en el crecimiento, la proliferación y diferenciación celular) participan en la patogénesis y progresión de diferentes cánceres. Estas vías y moléculas de señalización asociadas representan dianas atractivas para la intervención terapéutica, aunque cada vez resulta más evidente que las diferentes poblaciones de pacientes presentan tumores que parecen estar desregulados de diferentes maneras. Por ejemplo, una diana terapéutica concreta (o una combinación de dianas terapéuticas) puede estar presente solamente en los tumores de determinadas poblaciones de pacientes y, por tanto, la identificación de estas poblaciones que presentan la diana (o una combinación de dianas) se puede utilizar para clasificar a los pacientes como potenciales respondedores o potenciales no respondedores a un agente terapéutico (o a una combinación de terapéuticos) dirigido contra la diana (o dianas) . El uso de diagnósticos complementarios para clasificar a los pacientes de esta manera es un primer paso para personalizar el tratamiento del cáncer en los pacientes individuales. Una mayor individualización de los tratamientos implicará indudablemente ensayos multiplexados para múltiples dianas terapéuticas.

WO 95/03296A1 divulga sustancias intermedias de hapteno unidas y conjugados relacionados a base de carbazol y/o dibenzofurano.

Anónimo: “Polyclonal Anti-Conjugated Rotenene Antibodies (rat) ”, Hoja de datos AP115, 5 de abril de 2006, recuperado de Internet:

URL:http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/GEM_/AP115.20060405.pdf, divulga rotenona sintética conjugada con vehículos de proteína.

Lamentablemente, en los últimos años se han realizado muy pocas investigaciones dirigidas al desarrollo de otras clases de haptenos contra las que se puedan activar anticuerpos sensibles y específicos, para poder realizar ensayos altamente multiplexados. Estos ensayos altamente multiplexados serían útiles para controlar la respuesta de los individuos a un determinado régimen terapéutico y para las aplicaciones de diagnóstico relacionadas. La identificación de clases adicionales de haptenos y métodos para su uso en aplicaciones analíticas y terapéuticas representaría un importante avance de la técnica en este campo.

Resumen Por tanto, debido a lo anteriormente expuesto, la técnica precisa de haptenos y conjugados de haptenos adicionales, que sean útiles para el diagnóstico y/o aplicaciones terapéuticas. Por consiguiente, determinadas realizaciones divulgadas de la presente invención se refieren a nuevas clases de haptenos, conjugados de haptenos y composiciones de los mismos.

La presente invención se define en las reivindicaciones De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar dos o más dianas en una muestra que consiste en:

poner en contacto la muestra con dos o más fracciones de unión específica que se unen específicamente a dos o más dianas diferentes, donde las dos o más fracciones de unión específica se conjugan con diferentes haptenos, siendo al menos uno de ellos una primera isoxazolina de rotenona con la fórmula:

donde R-R5 son independientemente hidrógeno, aldehido, alcoxi, alifático, alifático sustituido, heteroalifático, amino, aminoácido, amido, ciano (-CN) , halógeno, hidroxilo, hidroxilamina, oxima, éter de oxima, alquilo hidroxilo, cetona, nitro, sulhidrilo, sulfonilo, sulfoxida, carboxilo, carboxilato, éster, éster de alquilo, acilo, exometileno, éter, cíclico, heterocíclico, arilo, alquilo arilo, heteroarilo, carbohidrato, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos, Y es oxígeno, una amina, o sulfuro y al menos uno de los sustituyentes R-R5 está unido a un conector o una molécula portadora, siendo el otro hapteno un oxasol, un pirazol, un tiazol, un bemzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un nitroarilo distinto de dinitrofenilo, una segunda isoxazolina de rotenona diferente de la primera isoxazolina de rotenona, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiacepina;

poner en contacto la muestra con dos o más anticuerpos anti-hapteno... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar dos o más dianas diferentes en una muestra, que consiste en lo siguiente:

poner en contacto la muestra con dos o más fracciones de unión específica que se unen específicamente a dos o más dianas diferentes, donde las dos o más fracciones de unión específica se conjugan con diferentes haptenos, siendo al menos uno de los haptenos una primera isoxazolina de rotenona con la fórmula donde R-R5 son, independientemente, hidrógeno, aldehído, alcoxi, alifático, alifático sustituido, heteroalifático, amino, aminoácido, amido, ciano (-CN) , halógeno, hidroxilo, hidroxilamina, oxima, éter de oxima, alquil hidroxil, cetona, nitro, sulfhidrilo, sulfonilo, sulfóxido, carboxilo, carboxilato, éster, éster de alquilo, acilo, exometileno, éter, cíclico, heterocíclico, arilo, alquil arilo, heteroarilo, carbohidrato, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos; Y es oxígeno, una amina o azufre; y al menos uno de los sustituyentes R-R5 está

unido a un conector o a una molécula vehículo, siendo el otro hapteno un oxazol, un pirazol, un tiazol, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un nitroarilo distinto de dinitrofenilo, una segunda isoxazolina de rotenona distinta de la primera isoxazolina de rotenona, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiacepina;

poner en contacto la muestra con dos o más anticuerpos anti-hapteno diferentes que se pueden detectar por 20 separado; y

detectar los anticuerpos anti-hapteno.

2. Un método para detectar una diana en una muestra, que consiste en lo siguiente: poner en contacto la muestra con una fracción de unión específica que se une de forma específica a una diana, estando conjugada la 25 fracción de unión específica con un hapteno de isoxazolina de rotenona con la fórmula poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente al hapteno de isoxazolina de rotenona; y

detectar el anticuerpo que se une específicamente al hapteno de isoxazolina de rotenona:

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la primera isoxazolina de rotenona tiene una fórmula donde R-R2 y R4-R5 son, independientemente, alifático, alcoxi, alquil hidroxilo, hidrógeno o hidroxilo.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el otro hapteno es y/o donde el otro hapteno es y/o el otro hapteno es y/o el otro hapteno es y/o el otro hapteno es y/o el otro hapteno es y/o el otro hapteno es y/o el otro hapteno es

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R-R5 10 son, independientemente, alifático, alifático sustituido, hidrógeno o hidroxilo.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde Y es oxígeno.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R-R5 15 son, independientemente, hidrógeno o hidroxilo, e Y es oxígeno.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde Y es -NH.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3 que consiste asimismo en lo

siguiente: poner en contacto la muestra con una segunda fracción de unión específica, que se une de forma específica a una segunda diana diferente en la muestra, estando la segunda fracción de unión específica conjugada con un hapteno de heteroarilo que tiene una estructura química o bien conjugada con un hapteno de heteroarilo que tiene una estructura química o bien 10 conjugada con un hapteno de azoarilo que tiene una estructura química o bien conjugada con un hapteno de benzodiacepina que tiene una estructura química poniendo en contacto la muestra con un segundo anticuerpo que se une específicamente al hapteno de heteroarilo; y

158 detectando el segundo anticuerpo que se une específicamente al hapteno de heteroarilo de forma separada del anticuerpo que se une específicamente al hapteno de isoxazolina de rotenona.

FIGURA 5