Genes de toxinas de distensión citoletales como dianas para la detección de bacterias Campylobacter.

Método para detectar la presencia de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni en una muestra de prueba,

que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba usando un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni; y

(b) determinar la presencia de una Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni basándose en la presencia o el peso molecular de un fragmento amplificado a partir del ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni,

en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51, y la figura 17, respectivamente, y en el que el par de cebadores comunes es uno cualquiera de un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 64 y 65, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10, y un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 66 y 67

Genes de toxinas de distensión citoletales como dianas para la detección de bacterias Campylobacter

Campo técnico

La presente invención se refiere a las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli y a polinucleótidos que codifican para las mismas. La presente invención también se refiere a métodos para determinar la presencia de bacterias Campylobacter en muestras de prueba (tales como muestras clínicas y alimentos) seleccionando como diana toxinas de distensión citoletales de bacterias Campylobacter, incluyendo Campylobacter coli.

Técnica anterior

Las bacterias Campylobacter son microorganismos que son patógenos para seres humanos así como para animales salvajes y domésticos y que provocan aborto y enteritis en animales y enteritis en seres humanos. Se sabe que Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son bacterias causantes de infección por Campylobacter en seres humanos. A estas bacterias con frecuencia se les denomina bacterias de intoxicación de alimentos (véanse los documentos no de patente 1 y 2) .

A fecha de 2000, se ha clasificado Campylobacter en 15 especies y 9 subespecies. C. jejuni constituye del 95 al 99% de las bacterias que se aíslan en casos de diarrea en seres humanos, mientras que otras especies bacterianas, tales como C. coli, sólo constituyen un pequeño porcentaje (véase el documento no de patente 3) . Sin embargo, la tasa de portadores de C. coli es extremadamente alta en cerdos. En los últimos años, la infección por Campylobacter ha presentado una tendencia creciente al aumentar las importaciones de carne principalmente desde el Sudeste Asiático. En particular, la infección por alimentos relacionados con pollos, cuyo consumo ha estado creciendo como resultado de problemas con la ternera tales como BSE y O-157, ha aumentado rápidamente.

Además, aunque se ha conocido Campylobacter fetus como bacterias causantes de aborto en ovejas y animales bovinos, sólo recientemente se ha notificado que también está implicada en el aborto y el parto prematuro en seres humanos. La infección por C. fetus, que resulta de comer hígado crudo o ternera contaminada con C. fetus, está asociada con síntomas tales como septicemia y meningitis. La fuente principal de infección por Campylobacter en seres humanos es el pollo, que porta las bacterias a altas densidades en el tracto intestinal (documento no de patente 4) .

Generalmente las bacterias Campylobacter se distribuyen a una alta densidad en el tracto digestivo de animales, tales como animales bovinos, ovejas, cerdos y pollos, y por tanto se reconocen como bacterias causantes de zoonosis. Se piensa que la mayoría de las campilobacteriosis está provocada por pollos. La infección puede surgir mediante contacto directo con los animales anteriores o con sus excrementos, o mediante la ingesta, o durante el procesamiento, de alimentos, agua potable, leche y similares contaminados con los excrementos. Además, también se han notificado casos de infección en instalaciones tales como salas de recién nacidos (véase el documento no de patente 5) .

La campilobacteriosis tiene un periodo de incubación largo, que oscila entre 3 y 7 días. Se caracteriza por síntomas de gastroenteritis, tales como diarrea (algunas veces, diarrea mucosa con sangre) , dolor abdominal, fiebre, náuseas, vómitos, cefalea, escalofríos y debilidad. Aunque la letalidad es baja, los bebés recién nacidos pueden desarrollar infección sistémica, tal como septicemia y meningitis. En la mayoría de los casos, la recuperación tarda de varios días a aproximadamente una semana. El pronóstico general tiene un transcurso favorable excepto en algunos pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, en los últimos años se ha notificado que los pacientes pueden desarrollar síndrome de Guillain-Barre o síndrome de Fischer, que son enfermedades autoinmunitarias, tras campilobacteriosis. Los casos desarrollados tras campilobacteriosis tienden generalmente a volverse graves, y la tasa de remisión tras un año desde la aparición es de tan sólo aproximadamente el 60%.

Se realiza quimioterapia usando antibióticos para estados graves o casos complicados por septicemia. El fármaco de primera elección es macrólido, tal como eritromicina. Debido a la resistencia natural, no se espera que antibióticos de cefem tengan efectos terapéuticos. Mientras tanto, el aumento en el número de bacterias resistentes a nuevos antibióticos de quinolona se ha convertido en un problema en los últimos años. La rápida identificación de microorganismos causantes tras la infección es importante para realizar un tratamiento apropiado para la campilobacteriosis y para prevenir la expansión de la infección revelando la vía de infección. Sin embargo, resulta difícil diagnosticar la campilobacteriosis basándose en síntomas clínicos solos, por no hablar de identificar el Campylobacter y su especie.

Las bacterias Campylobacter son microaerófilas. Un cultivo de las bacterias requiere un medio especial tal como medio de Skirrow, y un aparato especial (frasco anaerobio o similar) para mantener la concentración de oxígeno a del 3 al 10% para la condición microaerófila absoluta. Además, el cultivo requiere mucho tiempo (de 2 a 3 días) en comparación con otras bacterias. Por tanto, es difícil alcanzar y mantener un cultivo en aislamiento de bacterias Campylobacter. Además, dado que las bacterias Campylobacter mueren fácilmente en el aire, deben someterse a prueba en el plazo de 2 a 3 horas tras la recogida de la muestra. Además, dado que el periodo de incubación de la campilobacteriosis es largo (de 3 a 7 días) , con frecuencia no pueden aislarse las bacterias cuando se lleva a cabo la identificación de bacterias en cualquier alimento afectado tras la aparición de los síntomas. Además, las bacterias Campylobacter tienen una infectividad muy fuerte, y se ha notificado que establecen infección con tan sólo algunos cientos de células. Por tanto, es extremadamente difícil identificar la fuente de la infección.

Un método de diagnóstico de distinción entre C. jejuni y C. coli implica someter a prueba la hidrólisis de hipurato. Específicamente, el método se basa en el hecho de que C. jejuni tiene la capacidad de hidrolizar hipurato mientras que C. coli no. Sin embargo, este método no es exacto porque en la técnica se conocen algunas especies de C. jejuni negativas para hipurato (véase el documento no de patente 6) . Por tanto, la presencia de bacterias Campylobacter sólo puede confirmarse estimando la presencia de las bacterias a partir del historial de ingesta de alimentos y de los síntomas, y examinando características morfológicas y biológicas de las bacterias a partir de colonias obtenidas mediante cultivo de heces, lo que requiere varios días.

Por tanto, se han realizado intentos de identificar bacterias Campylobacter y detectar sus genes de toxina usando, como métodos de diagnóstico rápido que no requieren cultivo, métodos de diagnóstico genético que usan un método de sonda de ADN o un método de PCR usando oligonucleótidos. Por ejemplo, generalmente se ha usado el ARNr que codifica para genes como sonda para bacterias Campylobacter (véase el documento de patente 1) . Ya se han publicado las secuencias de genes de ARNr de Campylobacter (véase el documento no de patente 7) . Además, también se conocen fragmentos de ácido nucleico para detectar bacterias Campylobacter (véanse los documentos de patente 2, 3, 4, 5 y 6) . Sin embargo, aunque pueden usarse estas secuencias para detectar C. jejuni y/o C. coli, no son adecuadas para detectar otras bacterias Campylobacter. Además, el nivel actual de especificidad no es suficiente.

Se han notificado la detección y el análisis de genes de cdt a partir de aislados de C. jejuni y C. coli mediante PCR (Eyigor et al., J. Clin. Microbiol., 37: 1646-1650 (1999) ) . También se ha notificado un método para identificar C. jejuni mediante PCR, usando oligonucleótidos seleccionados del gen de flaA de C. coli VC167 (véase el documento no de patente 8) . Además, se ha notificado en la bibliografía el uso de cebadores de oligonucleótidos para amplificar una secuencia diana de superóxido dismutasas de C. jejuni y C. coli (véase el documento de patente 7) . Sin embargo, estos métodos no pueden distinguir entre C. jejuni y C. coli.

Mientras tanto, están estudiándose activamente los factores patógenos de Campylobacter. Se han notificado diversos factores, tales como invasividad celular, flagelina y enterotoxina similar a toxina del cólera, como factores patógenos de bacterias Campylobacter (véanse los documentos no de patente 9 y 10) . Recientemente, se descubrió la toxina de distensión citoletal (CDT) como factor tóxico de C. jejuni (documento no de patente 11) , y... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar la presencia de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba usando un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni; y

(b) determinar la presencia de una Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni basándose en la presencia o el peso molecular de un fragmento amplificado a partir del ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y/o Campylobacter jejuni,

en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51, y la figura 17, respectivamente, y en el que el par de cebadores comunes es uno cualquiera de un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 64 y 65, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10, y un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 66 y 67.

2. Método para detectar la presencia de Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, y/o Campylobacter fetus en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba usando una mezcla de pares de cebadores específicos para cada uno de los ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de estas bacterias; y

(b) determinar la presencia de las bacterias basándose en la presencia o el peso molecular de fragmentos amplificados a partir de los ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de las bacterias,

en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, respectivamente, y en el que la mezcla de pares de cebadores específicos es la siguiente:

(i) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 70 y 71 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 68 y 69 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 72 y 73 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus;

(ii) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 13 y 14 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 11 y 12 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 15 y 16 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus; o (iii) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 76 y 77 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 74 y 75 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 78 y 79 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus.

3. Método para detectar la presencia de Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, y/o Campylobacter fetus en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba usando un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión

citoletales de estas bacterias;

(b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba o con el ADN genómico amplificado en la etapa (a) como molde usando una mezcla de pares de cebadores específicos para cada uno de los ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de las bacterias; y

(c) determinar la presencia de las bacterias basándose en la presencia o el peso molecular de fragmentos amplificados a partir de los ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de las bacterias, en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, respectivamente, y en el que el par de cebadores comunes es uno cualquiera de un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 64 y 65, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10, y un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 66 y 67, y en el que la mezcla de pares de cebadores específicos es la siguiente:

(i) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 70 y 71 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 68 y 69 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 72 y 73 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus;

(ii) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 13 y 14 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 11 y 12 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 15 y 16 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus; o (iii) un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 76 y 77 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter coli;

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 74 y 75 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter jejuni; y

un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 78 y 79 para amplificar un ADN genómico que codifica para la toxina de distensión citoletal de Campylobacter fetus.

4. Método para detectar la presencia de Campylobacter coli, Campylobacter jejuni y/o Campylobacter fetus en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra de prueba usando un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómicos que codifican para subunidades cdtB de las toxinas de distensión citoletales de estas bacterias;

(b) digerir el ADN genómico amplificado en la etapa (a) con una enzima de restricción; y

(c) determinar la presencia de las bacterias basándose en el peso molecular de un fragmento de ADN resultante de la digestión, en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, respectivamente, y en el que el par de cebadores comunes es un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, o un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la enzima de restricción se selecciona del grupo que consiste en: Sau3AI, DsaI, MboI, Rsal, EcoRI, HinfI, NdeI, PstI, Xbal y XhoII.

6. Kit, que comprende un manual de instrucciones y un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de bacterias Campylobacter, en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de bacterias Campylobacter es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, y en el que el par de cebadores comunes se selecciona del grupo que consiste en: un par de cebadores que comprende las secuencias de

SEQ ID NO: 64 y 65, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10 y un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 66 y 67.

7. Kit, que comprende un manual de instrucciones y una mezcla de pares de cebadores específicos para cada

uno de los ADN genómicos que codifican para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter jejuni y Campylobacter fetus, en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, respectivamente, y en el que la mezcla de pares de cebadores específicos es tal como se definió en la reivindicación 2.

8. Kit según la reivindicación 7, que comprende además un par de cebadores comunes que puede amplificar ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter jejuni y Campylobacter fetus, en el que el ADN genómico que codifica para las toxinas de distensión citoletales de Campylobacter coli, Campylobacter fetus y Campylobacter jejuni es un ADN tal como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51 y la figura 17, respectivamente, en el que el par de cebadores comunes se selecciona de un par de cebadores de las secuencias de SEQ ID NO: 65 y 64, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, un par de cebadores que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10 y un par de cebadores de las secuencias de SEQ ID NO: 66 y 67.