Generación de plantas con contenido de aceite alterado.

Una planta transgénica que comprende un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citrato sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO:

2, en donde la secuencia de nucleótidos es expresada en exceso con respecto a una la planta de control no transgénica, y por medio de la cual la planta transgénica tiene una un mayor porcentaje de masa de la semilla que es aceite con respecto a las plantas de control.

Generación de plantas con contenido de aceite alterado Antecedentes de la invención La capacidad para manipular la composición de las semillas de cultivos, concretamente el contenido y la composición de los aceites de semillas, tiene importantes aplicaciones en la industria agrícola, con respecto a los aceites alimentarios procesados como a aceites para la alimentación animal. Las semillas de los cultivos agrícolas contienen una variedad de componentes valiosos, incluyendo aceite, proteína y almidón. El procesamiento industrial puede separar algunos o todos estos componentes para su venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, casi 60% de la cosecha de soja de los Estados Unidos es triturada por la industria de procesamiento de soja. El procesamiento de la soja produce aceite purificado, que se comercializa a un alto valor, mientras que el resto se comercializa principalmente para la alimentación del ganado vacuno de menor valor (US Soybean Board, 2001 Soy Stats) . La semilla de canola se tritura para producir aceite y co-producto de harina de canola (Canola Council of Canada) . Casi 20% de la cosecha de maíz de los Estados Unidos 1999/2000 fue refinado industrialmente, principalmente para la producción de almidón, etanol y aceite (Corn Refiners Association) . De este modo, a menudo es deseable maximizar el contenido de aceite de las semillas. Por ejemplo, para las semillas oleaginosas procesadas tales como la soja y la canola, el aumento del contenido de aceite absoluto de la semilla aumentará el valor de tales granos. Para el maíz procesado se puede desear aumentar o disminuir el contenido de aceite, dependiendo de la utilización de otros componentes principales. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado mediante la reducción de sabores no deseados asociados con la oxidación del aceite. Por otra parte, en la producción de etanol, donde el sabor no es importante, el aumento del contenido de aceite puede aumentar el valor global. En muchos cereales forrajeros, tales como el maíz y el trigo, es deseable aumentar el contenido de aceite de la semilla, debido a que el aceite tiene un mayor contenido de energía que otros componentes de semillas tales como los hidratos de carbono. El procesamiento de semillas oleaginosas, como la mayoría de los negocios de procesamiento de grano, es un negocio intensivo en capital: por lo tanto los pequeños desplazamientos en la distribución de los productos de los componentes de escaso valor al componente oleoso de gran valor pueden tener consecuencias económicas considerables para los procesadores de grano.

La manipulación biotecnológica de los aceites puede proporcionar la alteración de la composición y la mejora del rendimiento de aceite. Las alteraciones en la composición incluyen soja y aceite de maíz de alto contenido oleico (Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.229.033 y 6.248.939) , y semillas que contienen laurato (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.639.790) , entre otras. El trabajo en la alteración de la composición se ha centrado principalmente en las semillas oleaginosas procesadas pero ha sido fácilmente ampliable a cultivos distintos de semillas oleaginosas, incluyendo el maíz. Si bien existe un interés considerable en el aumento del contenido de aceite, la única biotecnología llevada a la práctica en la actualidad en esta área es la tecnología de Maíz con Alto Contenido de Aceite (HOC por "High-Oil Corn") (DuPont, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.704.160) . En la HOC se emplean polinizadores de alto contenido de aceite desarrollados por cría selectiva clásica, junto con hembras híbridas (con esterilidad masculina) selectas en un sistema de producción al que se hace referencia como TopCross. El sistema TopCross High Oil eleva el contenido de aceite de los granos recolectados de maíz de ~3, 5% a ~7%, mejorando el contenido de energía del grano.

Si bien ha sido fructífero, el sistema de producción HOC presenta limitaciones inherentes. En primer lugar, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables del conjunto de semillas de un campo completo contiene riesgos inherentes, concretamente en años de sequía. En segundo lugar, los contenidos de aceite en los actuales campos de HOC han alcanzado una meseta de aproximadamente 9% de aceite. Por último, el maíz con alto contenido de aceite no es esencialmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (aumento del tamaño del embrión) que presenta el resultado indirecto de un aumento del contenido de aceite. Por estas razones, sería especialmente valiosa una estrategia alternativa para alto contenido de aceite, concretamente una que derivara de una producción bioquímica alterada.

Los cultivos diana más evidentes para el mercado de aceite procesado son la soja y la colza, y una gran recopilación de trabajo comercial (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.952.544; Solicitud PCT WO 9411516) demuestra que Arabidopsis es un excelente modelo para el metabolismo de aceite en estos cultivos. Escrutinios bioquímicos de la composición del aceite de semillas han permitido identificar genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas y han conducido a la identificación de genes ortólogos de importancia agronómica. Por ejemplo, escrutinios en los que se utilizan poblaciones sometidas a mutagénesis química han identificado mutantes de lípidos cuyas semillas presentan una composición de ácidos grasos alterada (B. Lemieux, et al. 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 234-240; James DW y Dooner HK (1990) Theor. Appl. Genet. 80, 241-245) . Escrutinios de mutagénesis por ADN-t (Feldmann et al., Science 243: 1351-1354, 1989) que detectaban una composición de ácidos grasos alterada identificaron los genes de omega 3 desaturasa (FAD3) y delta-12 desaturasa (FAD2) (Patente de los Estados Unidos Núm. 5952544; Yadav NS et al. (1993) Plant Physiol. 103, 467-476; Okuley et al., Plant Cell. Enero de 1994; 6 (1) :147-58) . En un escrutinio que se centró en el contenido de aceite en lugar de en la calidad del aceite, se analizaron mutantes inducidos químicamente para determinar semillas rugosas o la densidad de semillas alterada, a 2 10

partir de lo cual se infería un contenido alterado de aceite de semillas (Focks N y Benning C, Plant Physiol. 118:91101, 1998) . Otro escrutinio, diseñado para identificar las enzimas implicadas en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga, identificó una mutación en el gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) como responsable de la acumulación reducida de triacilglicerol en las semillas (Katavic V. et al, Plant Physiol. Mayor de 1995; 108 (1) :399-409) . Se demostró adicionalmente que la expresión en exceso, específica de semillas, del ADNc de DGAT estaba asociada con el aumento de contenido de aceite en las semillas (Jako et al., Plant Physiol. Junio de 2001; 126 (2) :S61-74) .

Compendio de la Invención La invención proporciona una planta transgénica que tiene un fenotipo de alto contenido de aceite. La planta transgénica comprende un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citrato sintasa. En realizaciones preferidas, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de semillas de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, aceite de palma, palma de coco, lino, ricino y cacahuete. La invención proporciona adicionalmente un método para producir aceite, que comprende cultivar la planta transgénica y recuperar el aceite de dicha planta.

La planta transgénica de la invención se produce mediante un método que comprende introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citrato sintasa, y cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia de polinucleótidos de citrato sintasa es expresada ocasionando el fenotipo de alto contenido de aceite.

Descripción detallada de la invención Definiciones A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Para las definiciones y los términos de la técnica, los profesionales son particularmente remitidos a Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laborator y Manual (Segunda Edición) , Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York, 1989, y Ausubel FM et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1993. Se ha de entender que esta invención no se limita a la metodología,... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgénica que comprende un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citrato sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos es expresada en exceso con respecto a una la planta de control no transgénica, y por medio de la cual la planta transgénica tiene una un mayor porcentaje de masa de la semilla que es aceite con respecto a las plantas de control.

2. Una planta transgénica de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2.

3. La planta transgénica de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2.

4. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

5. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona del grupo que consiste en semillas de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

6. Un tejido u órgano transgénico de la planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. El tejido u órgano transgénico de la reivindicación 6, que es una semilla.

8. Un método de producción de aceite que comprende el cultivo de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la recuperación del aceite de dicha planta.

9. Un método para producir una planta que tiene un mayor porcentaje de masa de la semilla que es aceite, comprendiendo dicho método:

a) introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citrato sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con el SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos es expresada en exceso con respecto a una planta de control no transgénica, y

b) cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia de polinucleótidos es expresada, y dicha planta transgénica muestra un aumento del porcentaje de masa de la semilla que es aceite con respecto a las plantas de control.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2.

11. El método de la reivindicación 9 ó 10, en donde dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

13. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de semillas de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

14. El uso de una molécula de ácido nucleico de citrato sintasa que comprende una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1 para identificar si una planta que tiene un mayor porcentaje de masa de la semilla que es aceite comprende una mutación en el SEQ ID NO: 1 o un alelo del SEQ ID NO: 1 que causa el aumento del porcentaje de la masa de la semilla que es aceite.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el alelo o el SEQ ID NO: 1 mutado codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde el alelo o el SEQ ID NO: 1 mutado codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que emplea la metodología del gen candidato/QTL.