Factor VIII, factor de von Willebrand o sus complejos con semivida in vivo prolongada.

Un factor de von Willebrand (VWF) modificado o un complejo que comprende factor VIII (FVIII) no modificado y VWF modificado,

donde el VWF modificado está fusionado en una parte C-terminal del polipéptido de traducción primario de VWF con la parte N-terminal de un polipéptido que mejora la semivida (HLEP), donde el HLEP es albúmina y donde

a. el VWF modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con la semivida funcional del correspondiente VWF de origen natural o

el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

Factor VIII, factor de von Willebrand o sus complejos con semivida in vivo prolongada Campo de la invención:

La presente invención se refiere a secuencias modificadas de ácido nucleico para el factor de von Willebrand (VWF, por sus siglas en inglés), así como también a sus complejos y sus derivados, a vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de ácido nucleico, a células huésped transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, a polipéptidos recombinantes y derivados codificados por dichas secuencias de ácido nucleico donde los polipéptidos recombinantes y derivados poseen actividades biológicas junto con una semivida in vivo prolongada y/o una recuperación in vivo mejorada en comparación con la proteína de origen natural no modificada. La presente invención se refiere además a procesos para la elaboración de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también se refiere a un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana, que comprende tales secuencias de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención:

Existen varios trastornos hemorrágicos provocados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más habituales son la hemofilia A y B, que son el resultado de deficiencias del factor de coagulación de la sangre VIII y IX, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand.

En plasma, FVIII existe principalmente como un complejo no covalente con VWF y su función coagulante consiste en acelerar la conversión, dependiente del factor IXa, del factor X en Xa. Debido a la formación del complejo de FVIII y VWF, se asumió durante mucho tiempo que las funciones de FVIII y VWF eran dos funciones de la misma molécula. Tan solo en los años 7 resultó obvio que FVIII y VWF eran moléculas diferentes que formaban un complejo en condiciones fisiológicas. A continuación, en los años 8, se determinó la constante de disociación de aproximadamente.2 nmol/L (Leyte ef al., Biochem J 1989, 257: 679-683) y se estudió la secuencia de ADN de ambas moléculas.

La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una deficiencia relacionada con el cromosoma X del factor FVIII de coagulación de la sangre y afecta casi exclusivamente a los hombres con una incidencia comprendida entre uno y dos individuos por cada 1. El defecto en el cromosoma X es transmitido por portadores femeninos que no son hemofílicos de por sí. La manifestación clínica de la hemofilia A consiste en una mayor tendencia a sufrir hemorragias. Antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de FVIII, la esperanza de vida media para una persona con hemofilia grave era inferior a 2 años. El uso de concentrados de FVIII procedentes de plasma ha mejorado de forma considerable la situación para los pacientes con hemofilia A, aumentando la esperanza de vida media considerablemente y proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. A pesar de ello, han habido ciertos problemas con los concentrados derivados de plasma y su uso, los más serios de los cuales han sido la transmisión de virus. Hasta ahora, los virus que provocan la hepatitis B, hepatitis que no sea de tipo A ni B y el SIDA han provocado estragos en la población. Desde entonces, se han desarrollado recientemente distintos métodos de desactivación de virus y nuevos concentrados de FVIII altamente purificados, los cuales establecen un estándar de seguridad muy elevado también para FVIII derivado de plasma.

La clonación de ADNc para FVIII (Wood et al. 1984. Nature 312:33-336; Vehar et al. 1984. Nature 312:337-342) permitió expresar FVIII de forma recombinante, lo cual llevó al desarrollo de varios productos de FVIII recombinantes, los cuales fueron aprobados por las autoridades reguladoras entre 1992 y 23. El hecho de que el dominio B central de la cadena polipeptídica de FVIII que reside entre los aminoácidos Arg-74 y Glu-1649 no parece ser necesario para obtener la actividad biológica completa también ha llevado al desarrollo de un FVIII con el dominio B suprimido.

La molécula de FVIII madura está constituida por2332 aminoácidos, los cuales se pueden agruparen tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos y un dominio B, los cuales están dispuestos en el siguiente orden: A1-A2- B-A3-C1-C2. La secuencia de aminoácidos completa de FVIII humano maduro se muestra en la SEQ ID NO:15. Durante su secreción en el plasma, FVIII es procesado intracelularmente para obtener una serie de heterodímeros unidos a iones metálicos a medida que FVIII monocatenario es escindido en la frontera de B-A3 y en diferentes sitios del dominio B. Este procesamiento proporciona moléculas heterogéneas de cadena pesada constituidas por el dominio A1, A2 y varias partes del dominio B, las cuales tienen un tamaño molecular comprendido entre 9 kDa y 2 kDa. Las cadenas pesadas están unidas mediante un ión metálico a las cadenas ligeras, que están constituidas por el dominio A3, C1 y C2 (Saenko et al. 22. Vox Sang. 83:89-96). En plasma, este FVIII heterodimérico se une con afinidad elevada al factor de von Willebrand (VWF), el cual lo protege contra un metabolismo prematuro. La semivida de FVIII no activado unido a VWF es de aproximadamente 12 horas en plasma.

El factor FVIII de coagulación se activa mediante la escisión proteolítica por parte de FXa y trombina en los aminoácidos Arg372 y Arg74 de la cadena pesada y en Arg1689 de la cadena ligera, lo cual provoca la liberación del factor de von Willebrand y la generación del heterotrímero de FVIII activado, el cual formará el complejo tenasa sobre superficies de fosfolípidos con FlXa y FX, siempre que haya Ca2+ presente. El heterotrímero está constituido por el dominio A1, un fragmento de 5 kDa, el dominio A2, un fragmento de 43 kDa, y la cadena ligera (A3-C1-C2), un fragmento de 73 kDa. De este modo, la forma activa de FVIII (FVIIIa) está constituida por una subunidad A1 asociada a través de la unión a un ion metálico divalente a una cadena ligera A3-C1-C2 escindida por la trombina y una subunidad A2 libre asociada de forma relativamente débil con el dominio A1 y A3.

Para evitar una coagulación excesiva, FVIIIa debe ser desactivado poco después de su activación. No se considera que la desactivación de FVIIIa por parte de la Proteína C activada (APC, por sus siglas en inglés) mediante la escisión en Arg336 y Arg562 sea un paso limitante de la velocidad importante. En su lugar, se cree que es la disociación de la subunidad A2 unida covalentemente del heterotrímero la que constituye el paso limitante de la velocidad en la desactivación de FVIIIa tras la activación de la trombina (Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266 8957, Fay y Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267:13246-5). Este es un proceso rápido, lo cual explica la corta semivida de FVIIIa en plasma, que es tan solo de 2.1 minutos (Saenko etal. 22. Vox Sang. 83:89-96).

En pacientes con hemofilia A grave sometidos a un tratamiento profiláctico, FVIII debe ser administrado por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana, debido a la corta semivida en plasma de FVIII de aproximadamente 12 a 14 horas. Cada administración i.v. es molesta, se asocia con dolor y conlleva el riesgo de infección, especialmente debido a que principalmente se la realizan en casa los mismos pacientes o los padres de los niños a los que se les ha diagnosticado hemofilia A.

Por lo tanto, sería muy deseable crear un FVIII con una mayor semivida funcional, lo cual permitiría la elaboración de composiciones farmacéuticas que contuvieran FVIII, las cuales se deberían administrar con menos frecuencia.

Se han realizado varios intentos de prolongar la semivida de FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con receptores celulares (WO 3/93313A2, WO 2/6951A2), uniendo polímeros covalentemente a FVIII (WO 94/15625, WO 97/11957 y US 4973), encapsulando FVIII (WO 99/5536), introduciendo sitios de unión a metales novedosos (WO 97/3193), uniendo covalentemente el dominio A2 al dominio A3 ya sea mediante un enlace peptídlco (WO 97/4145 y WO 3/87355) o de tipo disulfuro (WO 2/1324A2) o uniendo covalentemente el dominio A1 al dominio A2 (W26/1859).

Otra estrategia para mejorar la semivida funcional de FVIII o VWF consiste en la PEGilación de FVIII (WO 27/12688, WO 26/53299, WO 24/75923) o la PEGilación de VWF (WO 26/7181), donde el VWF pegilado, al tener una mayor semivida, también mejoraría de forma indirecta la semivida de FVIII presente en plasma.

El factor VWF, el cual se encuentra ausente, funcionalmente defectuoso o únicamente disponible en una cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD,... [Seguir leyendo]

1. Un factor de von Willebrand (VWF) modificado o un complejo que comprende factor VIII (FVIII) no modificado y VWF modificado, donde el VWF modificado está fusionado en una parte C-terminal del polipéptido de traducción primarlo de VWF con la parte N-term¡nal de un polipéptido que mejora la semivida (HLEP), donde el HLEP es albúmina y donde

a. el VWF modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con la semivida funcional del correspondiente VWF de origen natural o

el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

2. El VWF modificado o el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado de acuerdo con la reivindicación 1, donde

a. el VWF modificado presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con la semivida del antígeno del correspondiente VWF de origen natural o

b. el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

3. El VWF modificado o el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde

a. el VWF modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo de VWF de origen natural o

b. el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo del complejo correspondiente que comprende FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

4. El VWF modificado o el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado de acuerdo con la reivindicación 3, donde el VWF modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 1% en comparación con la recuperación in vivo del correspondiente VWF de origen natural o el complejo que comprende dicho VWF modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 1% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

5. El VWF modificado o el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el VWF modificado presenta al menos un 1% de la actividad biológica del VWF de origen natural o el complejo que comprende el VWF modificado presenta al menos un 1% de la actividad biológica del complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.

6. El VWF modificado o el complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el HLEP está fusionado con un aminoácido de VWF situado a una distancia del aminoácido C-terminal de un máximo de un 5% de la longitud total del polipéptido de traducción primario de VWF, basándose en el número total de aminoácidos en el polipéptido de traducción primario de VWF.

7. El polipéptido modificado o el complejo de acuerdo con la reivindicación 6, donde se han eliminado 1-2 aminoácidos en el extremo C-termlnal natural del polipéptido de traducción primario de VWF y donde el aminoácido C-termlnal resultante del polipéptido VWF está fusionado con el aminoácido N-terminal de HLEP.

8. El polipéptido modificado o el complejo de acuerdo con la reivindicación 7, donde se ha eliminado el aminoácido C-termlnal natural del polipéptido de traducción primario de VWF y donde el aminoácido C-terminal resultante del polipéptido VWF está fusionado con el aminoácido N-terminal de HLEP.

9. Un polinucleótido o un grupo de polinucleótidos que codifican un polipéptido o un complejo que comprende dicho VWF modificado o un complejo que comprende dicho VWF modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

1. Un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9, o un grupo de plásmidos o vectores, donde dicho grupo comprende el grupo de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula huésped que comprende un polinucleótido o un grupo de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9 o un plásmido o vector o un grupo de plásmidos o vectores de acuerdo con la reivindicación 1.

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12. Un método para producir un VWF modificado, que comprende:

(a) cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones en las que se exprese el VWF modificado; y

(b) opcionalmente recuperar el VWF modificado de las células huésped o del medio de cultivo.

13. Una composición farmacéutica que comprende un VWF modificado o un complejo que comprende dicho VWF

modificado de acuerdo con de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un polinucleótido o grupo de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9, o un plásmido o vector o un grupo de plásmidos o vectores de acuerdo con la reivindicación 1.

14. El uso de un VWF o un complejo que comprende dicho VWF modificado de acuerdo con cualquiera de las 1 reivindicaciones 1-8, un polinucleótido o un grupo de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9, o un

plásmido o vector o grupo de plásmidos o vectores de acuerdo con la reivindicación 1, o de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de coagulación de la sangre.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde el trastorno de coagulación de la sangre es la hemofilia A.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde el trastorno de coagulación de la sangre es la enfermedad de

von Willebrand.

17. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 15 y 16, donde el tratamiento comprende terapia génica humana.

18. Un método para preparar un VWF modificado con un incremento de la semivida funcional, que comprende fusionar la parte N-terminal de un polipéptido que mejora la semivida con una parte C-terminal del polipéptido de

traducción primario de VWF.

19. Un método para preparar un complejo que comprende FVIII no modificado y VWF modificado mezclando FVIII de origen natural con un VWF modificado preparado mediante el método de la reivindicación 18.