Epítopos T CD4+ de la Survivina y sus aplicaciones.

Un péptido derivado de la isoforma alfa de la survivina para su utilización como antígenos en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer,

estando el péptido seleccionado de entre el grupo constituido por:

a) los péptidos de 13 a 18 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 17 y 34 de la isoforma alfa de la survivina,

b) los péptidos de 13 a 30 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 84 y 113 de la isoforma alfa de la survivina, y

c) los péptidos de 13 a 21 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 122 y 142 de la isoforma alfa de la survivina,

cuyos péptidos a), b) y c) se unen con una actividad de unión inferior a 1000 nM a al menos 4 moléculas HLA-II preponderantes en la población caucásica seleccionados de entre el grupo constituido por las moléculas HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLADRB5 y HLA-DP4 codificados respectivamente por los alelos HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301, DRB1*1501, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DP*0401 y DP*0402, la actividad de unión correspondiente al dicho péptido que inhibe el 50% de la unión máxima de un marcador biotinilado en una molécula HLA II/péptido de ensayo de competición, realizado en condiciones tales como las que se precisan en la Tabla dada a continuación para cada alelo HLA II:**Tabla**

cuyos péptidos a), b) y c) son capaces de inducir a los linfocitos T CD4+ específicos de la survivina.

Epítopos T CD4+ de la Survivina y sus aplicaciones La presente invención se refiere a péptidos que representan epítopos T CD4+ de la survivina aptos para ser presentados por moléculas HLA II preponderantes, principalmente entre la población caucásica, y a sus aplicaciones vacunales y diagnósticas.

Los antígenos tumorales agrupan un conjunto de proteínas expresadas por las células tumorales y que las células sanas expresan poco o nada, o que no se encuentran más que en algunos tipos celulares. Estos antígenos se clasifican en cinco categorías en función de su perfil de expresión: (1) antígenos específicos del paciente, que resultan de mutaciones puntuales ligadas a la tumorigénesis (MUM-1, CDK4, beta-catenina, HLA-A2, BCR-ABL, CASP-8) , (2) antígenos de tumores o antígenos CT (cancer testis) , que se expresan en muchos tumores y algunos tejidos sanos desprovistos de moléculas HLA convencionales (testículos, placenta, ovarios; antígenos MAGE, BAGE, GAGE, RAGE, NY-ESO1) , (3) antígenos de diferenciación que se expresan sea en el curso de la embriogénesis, o sea en tipos celulares muy particulares (tirosinasas, gp-100, Melan-A/mart-1, tiroglobulina, alfafetoproteína, CEA) , (4) antígenos sobre-expresados por los tumores (survivina, gp75, PSA, HER2/neu, p53, telomerasa) y (5) antígenos víricos (EBV, HPV) .

Todas estas proteínas pueden reconocerlas los Linfocitos T CD4+ y CD8+ y sirven para inducir una inmunidad celular representando dianas para la vacunación anti-tumoral (Solicitud Internacional PCT WO 2004/055183) .

Las dianas que se han estudiado particularmente bien son principalmente los antígenos específicos de tumores (MAGE, NY-ESO-1) . Sin embargo, estas dianas pueden ser ineficaces para la vacunación anti-tumoral, debido a que la mayoría no son esenciales para la supervivencia de las células tumorales que pueden escapar a la vigilancia inmunológica disminuyendo o reprimiendo la expresión de estos antígenos.

La survivina (16, 5 kDa) , también llamada BIRC5 (Proteína que contiene una PIA repetida Baculovírica 5) , PIA4 (Proteína inhibidora de apoptosis 4) o IAP4 (Inhibidora de apoptosis 4) es el miembro más pequeño de la familia de los inhibidores de apoptosis (IAP) ; contiene un motivo en dedo de zinc de 70 aminoácidos (dominio repetido de la proteína inhibidora de apoptosis de baculovirus BIR) , característica de todos los miembros IAP y un extremo C que comprende una hélice alfa superenrollada. El gen que codifica la survivina se localiza en el cromosoma 17 humano (17q25) u 11 murino (11 E2) ; el empalme alternativo de un pre-ARNm que comprende los exones 1, 2, 2B, 3 y 4, produce tres transcripciones: (1) una transcripción que comprende los exones 1, 2, 3, y 4 que codifica la isoforma alfa de la survivina (142 aminoácidos GenBank AAC51660 o SwissProt 015392) , (2) una transcripción que comprende los exones 1, 2, 2B, 3 y 4, que codifica la isoforma beta o survivina-2B (165 aminoácidos) que se produce como resultado de la inserción de la secuencia GPGTVAYACNTSTLGGRGGRITR (23 aminoácidos, SEC ID Nº 40) , entre las posiciones 74 y 75 de la secuencia de la isoforma alfa y (3) una transcripción que comprende los exones 1, 2, y 4, que codifican la survivina ΔEx3.

La survivina se sobre-expresa en la mayoría de los tumores, principalmente en aquellos que se asocian con los cánceres de mama, hígado, colon, pulmón, ovario, útero, esófago, estómago, páncreas, hígado y próstata, con la enfermedad de Hodgkin, con el síndrome mielodisplásico refractario con anemia, con melanomas, linfomas no Hodgkin, leucemias, neuroblastoma, feocromocitomas, sarcomas de tejidos blandos y tumores cerebrales. La sobreexpresión de esta proteína no redundante entraña una insensibilidad a la apoptosis y favorece la división celular. Por otra parte, esta sobre-expresión de la survivina es esencial para la supervivencia de las células tumorales; la supresión de la expresión de la survivina en las líneas celulares tumorales humanas por métodos antisentido, o mutantes negativos dominantes de la survivina da como resultado la detención de la división celular, y apoptosis (Yang y col., P.N.A.S., 2004, 101, 15100-15105; Altieri y col., Oncogene, 2003, 22, 8581-8589) .

Este antígeno tumoral es un buen indicador del pronóstico del cáncer, una tasa elevada de survivina (ARNm) se correlaciona con un pronóstico desfavorable (Takeuchi y col., Int. J. Cancer, 2005; Rodel y col., Cancer Rés., 2005, 65, 4881-4887; Muzio y col., CancerLett., 2005, 225, 27-33; Kim y col., Cancer Lett., 2005, 224, 253-261) .

Por el contrario, la survivina es prácticamente indetectable en los tejidos normales diferenciados. Posee una vida muy corta y está presente únicamente durante la mitosis donde participa en la formación del complejo CPP (Proteínas cromosómicas pasajeras) que comprende la Aurora quinasa B, la proteína INCENP (proteína interna del centrómero) y TD60 (Antígeno de disco de la telofase) , y está igualmente implicada en la inhibición de la apoptosis reprimiendo la actividad de las caspasas 3, 7, 9 (Schimmer, A.D., Cancer Research, 2004, 64, 7183-7190; Fortugno y col. J. Cell. Science, 2002, 115, 575-585) .

El estudio de la respuesta inmunitaria dirigida contra la survivina, en los individuos que padecen un cáncer, indica que este antígeno tumoral puede inducir una respuesta celular que implica a los linfocitos T CD4+ y T CD8+ específicos (Andersen y col., Cancer Research, 2001, 61, 869-872 y 5964-5968 ; Schmidt y col., Blood, 2003, 102, 571-576; Casati y col., Cancer Research, 2003, 63, 4507-4515 ; Ichiki y col., Lung Cancer, 2005, 48, 281-289) .

Casati y col., Cancer Research, 63, 4507-4515, 2003 desvelan que los pacientes que padecen cáncer colorrectal poseen células T CD4+ específicas de survivina. Se detectan igualmente anticuerpos específicos; la tasa elevada de

anticuerpos anti-survivina detectada en los casos de cáncer de pronóstico desfavorable indica sin embargo que la respuesta humoral no parece que esté implicada en el rechazo de tumores que expresan la survivina (Ichiki y col., ya citado) .

En consecuencia, la survivina representa una diana particularmente interesante para la vacunación antitumoral ya que induce una respuesta T CD4+ y T CD8+ específica de tumores, que se expresa en la mayor parte de los tumores y que su expresión es esencial para la supervivencia de los tumores. En efecto, la utilización de un antígeno esencial para la supervivencia de los tumores, como diana para la vacunación anti-tumoral permite evitar los problemas del escape de los tumores al reconocimiento por el sistema inmunitario. Además, la mayor parte de los cánceres se pueden tratar con una sola vacuna, ya que la survivina se expresa en la mayoría de los tumores.

Por lo tanto, se ha propuesto utilizar la survivina (proteína recombinante) , un vector de expresión de este antígeno o las células dendríticas transfectadas por tal vector de expresión, como una vacuna anti-tumoral (Solicitud Internacional PCT WO 00/03693; Pisarev y col., Clin., Cancer Res., 2003, 9, 6523-6533; Siegel y col., J. Immunol., 2003, 170, 5391-5397; Schaft y col., J. Immunol., 2005, 174, 3087-3097) . Sin embargo, para inducir a la vez una respuesta T CD4+ y una respuesta TCD8+ eficaces contra un antígeno, es preferible utilizar péptidos que representan epítopos T CD4+ y T CD8+ de este antígeno, más que la proteína entera.

Se han identificado epítopos T CD8+ de la survivina limitados a las moléculas HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7, B8, B15, B35 del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, (moléculas HLA I o Antígenos de leucocitos humanos clase I) (péptidos 95-104 y 96-104 limitados a HLA-A2 (Andersen y col., Cancer Res., 2001, 61, 869-872 ; Schmitz y col., Cancer Res., 2000, 60, 4845-4849 ; Schmidt y col., 2003, citado anteriormente; http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm ; Solicitud Internacional PCT WO 2004/067023) ; el péptido survivina 2B 80-88 se limitan a HLA-A24 (Hirohashi y col., Clin. Cancer Res., 2002, 8, 1731-1739) ; Recker y col., Int. J. Cancer 2004, 108, 937-941 y Cancer Biol. Ther., 2004, 3, 173-179; Bachinsky y col., Cancer Immun., 2005, 5, 6) . Se han utilizado células dendríticas autólogas cargadas con el péptido 96-104 para vacunar pacientes con melanoma (Andersen y col., Vaccine, 2005, 23, 884-889) .

Sin embargo, la inmunización con epítopos T CD8+ solos, inducen linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno tumoral, con una frecuencia muy débil (de aproximadamente 10-4 a 10-7 células CD8+; Zhang y col., Eur. J. Immunol., 2005, 35, 776-785) . De hecho, la inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) depende de la activación de linfocitos T CD4+ que intervienen en particular en... [Seguir leyendo]

1. Un péptido derivado de la isoforma alfa de la survivina para su utilización como antígenos en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer, estando el péptido seleccionado de entre el grupo constituido por:

a) los péptidos de 13 a 18 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 17 y 34 de la isoforma alfa de la survivina, b) los péptidos de 13 a 30 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 84 y 113 de la isoforma alfa de la survivina, y c) los péptidos de 13 a 21 aminoácidos consecutivos situados entre las posiciones 122 y 142 de la isoforma alfa de la survivina,

cuyos péptidos a) , b) y c) se unen con una actividad de unión inferior a 1000 nM a al menos 4 moléculas HLA-II preponderantes en la población caucásica seleccionados de entre el grupo constituido por las moléculas HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLADRB5 y HLA-DP4 codificados respectivamente por los alelos HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301, DRB1*1501, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DP*0401 y DP*0402, la actividad de unión correspondiente al dicho péptido que inhibe el 50% de la unión máxima de un marcador biotinilado en una molécula HLA II/péptido de ensayo de competición, realizado en condiciones tales como las que se precisan en la Tabla dada a continuación para cada alelo HLA II:

Alelos Marcadores (SEC ID Nº ) Concentración del marcador (nM) pH óptimo Tiempo de incubación (h)

DRB1*0101 DRB1*0301 DRB1*0401 DRB1*0701 DRB1*1101 DRB1*1301 DRB1*1501 DRB5*0101 DRB3*0101 DRB4*0101 DBP1*0401 DPB1*0402 29 31 29 33 29 32 30 29 34 35 36 36 1 200 30 10 10 100 30 10 10 10 1 1 6 4, 5 6 5 5 4, 5 4, 5 5, 5 5, 5 5 5 5 24 72 24 24 24 72 72 24 24 72 24 24

cuyos péptidos a) , b) y c) son capaces de inducir a los linfocitos T CD4+ específicos de la survivina.

2. Péptido para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 1, que se caracteriza porque dicho péptido es apto para ser presentado por al menos una molécula HLA-DP401 o HLA-DP402.

3. Péptido para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 1 o 2, que se caracteriza porque es seleccionado de entre el grupo constituido por los péptidos: 1731, 19-33.

2. 34.

8. 98.

9. 104.

9. 105.

9. 107.

9. 110 .

12. 142.

4. Péptido para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 3, que se caracteriza porque dicho péptido es apto para ser presentado por una molécula HLA-DP401 o HLA-DP402 y porque es seleccionado de entre el grupo constituido por los péptidos: 17-31, 19-33.

2. 34.

8. 98.

9. 104.

9. 105.

9. 107 .

9. 110.

5. Péptido para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 3 o 4, que se caracteriza porque dicho péptido es seleccionado de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº 5, 6, 7, 17, 19, 20, 21, 23 y 28.

6. Péptido para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque dicho péptido presenta una secuencia de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos.

7. Péptido para su utilización como un antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza porque dicho péptido está marcado o complejado.

8. Péptido para su utilización como un antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 7, que se caracteriza porque dicho péptido está complejado a una molécula HLA II marcada.

9. Fragmento poliepitópico que comprende la concatenación de al menos dos epítopos idénticos o diferentes en los que al menos uno es un epítopo T CD4+ de la survivina incluido en un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer.

10. Fragmento poliepitópico para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 9, que se caracteriza porque dicho fragmento poliepitópico comprende la concatenación de al menos un epítopo T CD4+ de la survivina incluido en un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y de al menos un epítopo T CD8+ de la survivina y/o un epítopo T CD4+ universal.

11. Fragmento poliepitópico para su utilización como antígeno según la reivindicación 10, que se caracteriza porque el epítopo T CD8+ es elegido de entre las secuencias SEC ID Nº 37 a 30.

12. Proteína de fusión constituida por una proteína o un fragmento de proteína, fusionada a un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento poliepitópico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer.

13. Proteína de fusión para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 12, que se caracteriza porque dicha proteína o dicho fragmento está seleccionado de entre el grupo constituido por una cadena alfa o beta de una molécula HLA II, correspondiendo un fragmento de dicha cadena a una moléculas HLA II soluble y una secuencia de dirección al endosoma.

14. Proteína de fusión para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer según la reivindicación 13, que se caracteriza porque dicha secuencia de dirección es derivada de la cadena invariante li

o de la proteína LAMP-1.

15. Un lipopéptido obtenido por la adición de un lípido en un grupo funcional α.aminado o un grupo funcional reactivo de la cadena lateral de un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de un fragmento poliepitópico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su utilización como antígeno en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer.

16. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un fragmento poliepitópico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o una proteína de fusión tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, para su utilización en la vacunación profiláctica o terapéutica del cáncer.

17. Composición inmunogénica o vacunal, que se caracteriza porque comprende al menos un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un fragmento poliepitópico según la reivindicación 10 u 11, una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un lipopéptido según la reivindicación 15 o un vector según la reivindicación 16, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, una sustancia portadora o un adyuvante.

18. Composición inmunogénica o vacunal según la reivindicación 17, que se caracteriza porque comprende al menos un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un péptido que incluye un epítopo T CD8+ de la survivina, bajo la forma de una mezcla de péptidos, de un fragmento poliepitópico y/o de un vector de expresión que codifica dichos péptidos o dicho fragmento.

19. Composición inmunogénica o vacunal según la reivindicación 18, que se caracteriza porque dicho epítopo T CD8+ es elegida de entre las secuencias SEC ID Nº 37 a 39.

20. Composición inmunogénica o vacunal según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que se caracteriza porque comprende al menos dos péptidos diferentes tales como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, seleccionados de entre el grupo constituido por una de las combinaciones siguientes:

- el péptido 17-31 y al menos uno de los péptidos 19-33.

9. 104 .

12. 142, -el péptido 19-33 y el péptid.

9. 110, -el péptid.

9. 104 y el péptido 17-31, -el péptid.

9. 110 y el péptid.

9. 104, y

-los péptido.

9. 107 .

12. 142, y al menos uno de los péptidos 17-31, 19-33.

9. 110 .

9. 104.

21. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que se caracteriza porque comprende un epítopo T CD4+ universal.

22. Procedimiento de diagnóstico in vitro, de evaluación del pronóstico o de seguimiento del tratamiento de un cáncer en un individuo, que se caracteriza porque comprende:

- la puesta en contacto, in vitro, de una muestra biológica de dicho individuo con un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y -la detección de linfocitos T CD4+ específicos de la survivina, por cualquier medio apropiado.

23. Procedimiento de selección de linfocitos T CD4+ específicos de la survivina, que se caracteriza porque comprende al menos las etapas siguientes:

- la puesta en contacto, in vitro, de una muestra celular con complejos multiméricos HLA II/péptido marcados, formados por la unión de moléculas HLA II solubles con al menos un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y -la selección de las células unidas a dichos complejos HLA II/péptido.

24. Péptido, que se caracteriza porque se trata de un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con la exclusión del péptido situado entre las posiciones 89 a 101 de la isoforma alfa de la survinina.

25. Fragmento poliepitópico que comprende la concatenación de al menos dos epítopos idénticos o diferentes de los que al menos un epítopo T CD4+ de la survivina se incluye en un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un epítopo T CD8+ de la survivina y/o un epítopo T CD4+ universal.

26. Proteína de fusión constituida por una proteína o un fragmento de proteína, fusionada con un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un fragmento poliepitópico según la reivindicación 25.

27. Lipopéptido obtenido por la adición de un lípido a un grupo funcional α-aminado o un grupo funcional reactivo de la cadena lateral de un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de un fragmento polipeptídico según la reivindicación 25.

28. Polinucleótido que codifica un péptido según la reivindicación 24, un fragmento poliepitópico según la reivindicación 25 o una proteína de fusión según la reivindicación 26.

29. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 28 bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas, de la transcripción y eventualmente de la traducción.

30. Célula huésped modificada por un polinucleótido según la reivindicación 28 o un vector de expresión según la reivindicación 29.

31. Kit de diagnóstico de evaluación del pronóstico o de seguimiento del tratamiento del cáncer, que se caracteriza porque comprende un péptido según la reivindicación 24.