Procedimiento de detección de sangre oculta.

Un procedimiento de diagnóstico diferencial de sangrado del tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto GI inferior,

que comprende la detección de transferrina y hemoglobina en una muestra de heces utilizando un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, y la comparación de la cantidades de transferrina y hemoglobina detectadas con los respectivos valores predeterminados de la transferrina y hemoglobina, en el que el resultado de la detección es indicativa de sangrado en el tracto GI inferior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está también por encima de un valor predeterminado para hemoglobina, y en el que el resultado de la detección es indicativo de sangrado del tracto gastrointestinal superior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está por debajo de un valor predeterminado para la hemoglobina, por lo que se realiza un diagnóstico diferencial de sangrado en el tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto gastrointestinal inferior.

Procedimiento de detección de sangre oculta Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, a la detección de sangre oculta de muestras del tracto gastrointestinal (GI) . La presente invención proporciona un procedimiento de detección simultánea de hemoglobina y transferrina usando muestras de kcal. El procedimiento de la presente invención proporciona una base para el diagnóstico diferencial del sangrado del tracto GI superior frente al tracto GI inferior.

Antecedentes de la invención La sangre oculta en heces ("FOB") es un buen indicador para monitorizar el sangrado del sistema gastrointestinal (GI) . Ya que pueden ser necesarios varios años para que algunos pólipos en el colon se transformen en cáncer colorrectal, la detección de sangrado por pólipos de colon es una forma eficaz para detectar el cáncer colorrectal en una etapa temprana. La implementación de un procedimiento de detección de sangre oculta en las muestras de heces de adultos de 50 años o más ha reducido la incidencia del cáncer colorrectal en un 20% y la mortalidad en un 30%.

Las pruebas de FOB disponibles en la actualidad incluyen una prueba química que detecta metabolitos de hemoglobina en las muestras de heces. La prueba emplea un sustrato oxidable (tal como guayacol) , que produce un producto coloreado en presencia de peróxido y hemoglobina. Como la mayoría de las moléculas hemo animales, los ingredientes vegetales y las vitaminas comunes también pueden catalizar la reacción de peróxido de hidrógeno, el control de la dieta es esencial para la especificidad de este tipo de prueba química. Un control de la dieta estricta plantea un serio problema el cumplimiento del paciente. De media no es inusual una tasa de cumplimiento inferior al 10%. Además, las pruebas químicas, en general, tienen una sensibilidad limitada. Por ejemplo, una prueba de FOB utilizando guayacol como sustrato tiene una sensibilidad de la prueba de 50 μg/ml, con una versión mejorada que tiene una sensibilidad de la prueba de 20 μg/ml.

Se ha desarrollado un inmunoensayo de tipo sándwich para la hemoglobina, que proporciona una mejor sensibilidad y especificidad de la prueba en comparación con las pruebas químicas. La necesidad de control de la dieta también se elimina para dicho inmunoensayo.

La hemoglobina es una proteína lábil; se degrada rápidamente en el sistema GI humano. La hemoglobina también es susceptible a la degradación durante el transporte y almacenamiento después de recoger las muestras de heces. Todos estos problemas de degradación de la muestra afectan a la precisión de la prueba de las pruebas de hemoglobina.

La transferrina es otro biomarcador para detectar sangre oculta en heces. En sangre humana normal, las concentraciones de transferrina y hemoglobina son de 3 mg / ml y 150 mg / ml, respectivamente. Por otro lado, la proporción entre hemoglobina y transferrina en muestras fecales es de aproximadamente 5, que es mucho menor que la proporción (aproximadamente 50) en la sangre. Esta observación indica que la transferrina es aproximadamente 10 veces más estable que la hemoglobina en el tracto GI. Se ha informado de que ciertas enfermedades pueden afectar a los niveles de transferrina en la sangre y las muestras de heces en la medida en que una prueba FOB basada en la transferrina sola puede producir resultados negativos falsos. Una combinación de pruebas para detectar tanto hemoglobina como transferrina puede mejorar la sensibilidad de la prueba sin sacrificar la especificidad de la prueba.

Otro de los retos para el desarrollo de un ensayo FOB es que muy pocos analizadores automatizados actualmente en el mercado pueden manejar muestras fecales. Por lo tanto, es deseable y se requiere una prueba rápida FOB en el sitio.

El documento EP1256802 describe una prueba de sangre oculta en heces eneal que la hemoglobina y / o la transferrina se utilizan como marcadores de sangre oculta en heces.

Chiang CH et al. "A, Comparative Study of Three Fecal Occult Blood Tests in Upper Gastrointestinal Bleeding". Kaohsiung J Med Sci May 2006;22:223-227 227 describe un estudio comparativo de evaluación de las características de rendimiento de tres pruebas de sangre oculta diferentes (la prueba de o-toluidina; la prueba OC-Hemodia, y la prueba de sangre oculta inmunocromatográfica Quick Chaser) en los casos de hemorragia del tracto gastrointestinal superior.

Miyoshi H et al. "Immunological Determination of Fecal Hemoglobin and Transferrin Levels: A Comparison with Other Fecal Occult Blood Tests", American Gournal of Gastroenterology 1992; 87:67-73 describe una comparación de una prueba de sangre oculta en heces que comprende la detección de hemoglobina y transferrina como con otra prueba de sangre oculta en heces (FECA-EIA) y dos pruebas químicas (guayacol y Hemoccult) en tres grupos de pacientes que comprenden un grupo de control, pacientes con cáncer de colon y pacientes con pólipos.

Uchida K et al. "Immunochemical detection of human blood in feces". Clinica Chimica Acta 1990;189:267-274 describe una prueba inmunoquímica de sangre oculta en heces utilizando un ensayo de inmunosorción ligado a enzimas de la hemoglobina y la transferrina humanas simultáneamente.

Miyoshi H et al, "Clinical study of a new fecal occult blood test using a combination assay of hemoglobin and transferrin", Gastroenterologia Japonica 1991;28:151-156 describe un estudio sobre la aplicabilidad de una prueba simultánea de sangre oculta en heces con hemoglobina y transferrina.

Lee EW et al, "Differential Diagnosis of Gastrointestinal Bleeding", Techniques in Vascular and Interventional Radiology 2005;7:112-122 es una revisión de las muchas causas de sangrado gastrointestinal y de las estrategias para la prestación de un diagnóstico específico.

Sumario de la invención Como se describe en la presente memoria con referencia a las reivindicaciones, la presente invención proporciona un procedimiento de diagnóstico diferencial de sangrado del tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto GI inferior, que comprende la detección de transferrina y hemoglobina en una muestra de heces utilizando un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, y la comparación de la cantidades de transferrina y hemoglobina detectadas con los respectivos valores predeterminados de la transferrina y hemoglobina, en el que el resultado de la detección es indicativa de hemorragia en el tracto GI inferior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está también por encima de un valor predeterminado para hemoglobina, y en el que el resultado de la detección es indicativo de sangrado del tracto gastrointestinal superior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está por debajo de un valor predeterminado para la hemoglobina, con lo que se realiza un diagnóstico diferencial de sangrado en el tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto gastrointestinal inferior.

En una forma de realización, dicho dispositivo comprende una tira de prueba que comprende: un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI; un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que un anticuerpo anti-transferrina marcado y un anticuerpo anti-hemoglobina marcado se depositan en dicho sitio conjugado; una zona de prueba corriente abajo de dicho sitio de conjugado, en el que dicha zona de prueba comprende dos sitios separados, uno de los cuales se inmoviliza con un anticuerpo anti-transferrina, y el otro está marcado inmovilizado con un anticuerpo anti-hemoglobina, y un sitio de control en el que un anticuerpo de control se inmoviliza en el mismo.

En otra forma de realización, dicho dispositivo comprende dos tiras de prueba, en la que una primera tira comprende: un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI; un sitio conjugado corriente abajo del sitio de la muestra, en el que un anticuerpo anti-transferrina marcado se deposita en dicho sitio conjugado; un zona de prueba corriente abajo de dicho sitio de conjugado, en el que dicha zona de ensayo comprende un sitio de prueba en el que un anticuerpo anti-transferrina se inmoviliza; un sitio de control en el que un anticuerpo control se inmoviliza; y en el que una segunda tira comprende: un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI; un sitio conjugado corriente abajo del sitio de la muestra, en el que un anticuerpo anti-hemoglobina marcado se deposita en dicho sitio conjugado; un zona de prueba corriente abajo de dicho sitio de conjugado, en el que dicha zona de ensayo comprende un sitio de prueba en el que un anticuerpo anti-hemoglobina... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico diferencial de sangrado del tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto GI inferior, que comprende la detección de transferrina y hemoglobina en una muestra de heces utilizando un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, y la comparación de la cantidades de transferrina y 5 hemoglobina detectadas con los respectivos valores predeterminados de la transferrina y hemoglobina, en el que el resultado de la detección es indicativa de sangrado en el tracto GI inferior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está también por encima de un valor predeterminado para hemoglobina, y en el que el resultado de la detección es indicativo de sangrado del tracto gastrointestinal superior cuando la cantidad de transferrina está por encima de un valor predeterminado para la transferrina y la cantidad de hemoglobina está por debajo de un valor predeterminado para la hemoglobina, por lo que se realiza un diagnóstico diferencial de sangrado en el tracto gastrointestinal superior en comparación con el tracto gastrointestinal inferior

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo comprende una tira de prueba, que comprende:.

1) un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI;

(2) un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que un anticuerpo antitransferrina marcado y un anticuerpo anti-hemoglobina marcado se depositan en dicho sitio conjugado;

(3) una zona de ensayo corriente abajo de dicho sitio de conjugado, en el que dicha zona de prueba

comprende dos sitios separados, uno de los cuales se inmoviliza con un anticuerpo anti-transferrina, y el 20 otro está marcado inmovilizado con un anticuerpo anti-hemoglobina; y

(4) un sitio de control en el que un anticuerpo de control se inmoviliza al mismo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo comprende dos tiras de prueba, en el que la primera tira comprende:

1) un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI;

(2) un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que un anticuerpo antitransferrina marcado es depositado en dicho sitio conjugado;

(3) un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que dicha zona de prueba comprende un sitio de prueba en el que es inmovilizando el anticuerpo anti-transferrina;

(4) un sitio de control en el que un anticuerpo de control es inmovilizado al mismo; y

en el que una segunda tira comprende:

1) un sitio de la muestra para la aplicación de una muestra GI;

(2) un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que un anticuerpo antihemoglobina marcado es depositado en dicho sitio conjugado;

(3) un sitio de conjugado corriente abajo de dicho sitio de la muestra, en el que dicha zona de prueba 35 comprende un sitio de prueba en el que es inmovilizando el anticuerpo anti-hemoglobina; y

(4) un sitio de control en el que un anticuerpo de control es inmovilizado al mismo.

4. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que dicha tira de prueba comprende una membrana de ensayo fabricada de nitrocelulosa..

5. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que dicho anticuerpo anti-transferrina marcado y dicho 40 anticuerpo anti-hemoglobina marcado son ambos anticuerpos conjugados a partículas de oro.

6. Uso de de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral en el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.