Conjugados de amatoxina con uniones mejoradas.

Conjugado de amatoxina de fórmula I**Fórmula**

Fórmula I

en la que:

R1 ≥ H u OH;

R2 ≥ H u OH;

R3 ≥ NH2 u OH;

R4 ≥ OH u O-alquilo C1-6; y

R5 ≥ L-T; en el que L es un grupo de unión y T es un resto de unión a dianas.

Conjugados de amatoxina con uniones mejoradas Campo de la invención

La invención se refiere a compuestos para su uso en terapia tumoral. En un aspecto, la presente invención se refiere a conjugados de una amatoxina y un resto de unión a dianas, por ejemplo un anticuerpo, conectado mediante determinadas uniones, que son útiles en el tratamiento de cáncer. En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden tales conjugados.

Antecedentes de la invención

Las amatoxinas son péptidos cíclicos que se componen de 8 aminoácidos. Pueden aislarse a partir de las setas Amanita phalloides o prepararse de manera sintética. Las amatoxinas inhiben específicamente la ARN polimerasa II dependiente de ADN de las células de mamífero, y por tanto también la transcripción y la blosíntesis de proteínas de las células afectadas. La inhibición de la transcripción en una célula provoca que se detenga el crecimiento y la proliferación. Aunque no está unido de manera covalente, el complejo entre amanitina y la ARN polimerasa II es muy fuerte (Kd = 3 nM). La disociación de amanitina de la enzima es un proceso muy lento, haciendo así que sea improbable la recuperación de una célula afectada. Cuando la inhibición de la transcripción dura demasiado tiempo, la célula experimentará muerte celular programada (apoptosis).

El uso de amatoxinas como restos citotóxicos para terapia tumoral ya se había examinado en 1981 mediante el acoplamiento de un anticuerpo anti-Thy 1.2 a a-amanitina usando un grupo de unión unido al anillo de indol del Trp (aminoácido 4; véase la figura 1) mediante diazotación (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). Davis & Presión identificaron el sitio de unión como la posición 7. Morris & Venton también demostraron que la sustitución en la posición T da como resultado un derivado que mantiene la actividad citotóxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-43).

La solicitud de patente EP 1859811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 27) describió conjugados en los que el átomo de C en y del aminoácido 1 de amatoxina de la p-amanitina se acopló directamente, es decir sin estructura de grupo de unión, a albúmina o a un anticuerpo monoclonal HEA125, OKT3 o PA-1. Además, se mostró el efecto inhibitorio de estos conjugados sobre la proliferación de células de cáncer de mama (MCF-7), células de linfoma de Burkitt (Raji) y células T de linfoma (Jurkat). Se sugirió el uso de grupos de unión, incluyendo grupos de unión que comprenden elementos tales como restos amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarbonados y similares, pero en realidad no se mostraron tales constructos, y no se proporcionaron más detalles, tales como sitios de unión en las amatoxinas.

Las solicitudes de patente WO 21/115629 y WO 21/11563 (ambas publicadas el 14 de octubre de 21) describen conjugados en los que anticuerpos, tales como anticuerpos anti-EpCAM tales como el anticuerpo humanizadohuHEA125, se acoplan a amatoxinas a través de (i) el átomo de C en y del aminoácido 1 de amatoxina, (ii) el átomo de C en 6 del aminoácido 4 de amatoxina o (iii) mediante el átomo de C en 5 del aminoácido 3 de amatoxina, en cada caso o bien directamente o bien mediante un grupo de unión entre el anticuerpo y las amatoxinas. Las grupos de unión sugeridos comprenden elementos tales como restos amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarbonados y similares. Además, se mostraron los efectos inhibitorios de estos conjugados sobre la proliferación de células de cáncer de mama (línea celular MCF-7), de carcinoma de páncreas (línea celular Capan-1), de cáncer de colon (línea celular Colo25) y de colangiocarcinoma (línea celular OZ).

Se sabe que las amatoxinas son relativamente no tóxicas cuando se acoplan a portadores de biomoléculas grandes, tales como moléculas de anticuerpo, y que ejercen su actividad citotóxica sólo después de que se escinda el portador de biomolécula. A la luz de la toxicidad de las amatoxinas, particularmente para las células hepáticas, es de extrema importancia que los conjugados de amatoxina para la terapia tumoral dirigida permanezcan altamente estables tras la administración en plasma, y que la liberación de la amatoxina se produzca tras la internalización en las células diana. En este contexto, mejoras menores de la estabilidad del conjugado pueden tener consecuencias drásticas para la ventana terapéutica y la seguridad de los conjugados de amatoxina para enfoques terapéuticos.

Objeto de la invención

Por tanto, existía una gran necesidad en la técnica anterior de conjugados de resto de unión a dianas-amatoxina que fuesen estables en plasma, de manera que se minimicen los efectos secundarios perjudiciales para las células que no son diana.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la observación inesperada de que pueden unirse restos de selección como diana a amatoxinas mediante grupos de unión en sitios de unión adicionales en el aminoácido 4 de triptófano,

concretamente en las posiciones 1 -N sin interferir en la interacción de tales amatoxinas con su diana, la ARN polimerasa II dependiente de ADN de las células de mamífero.

Por tanto, la presente invención se refiere a un conjugado que comprende un resto de unión a dianas unido mediante un grupo de unión L a una amatoxina, o un análogo de una amatoxina, en el que el grupo de unión L se conecta a la amatoxina mediante el átomo de N en 1 del aminoácido 4.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de amatoxina de fórmula I

Fórmula I

en la que:

R1 = H u OH;

R2 = H u OH;

R3= NH2uOH;

R4 = OH u O-alquilo C1-6; y

R5 = L-T; en el que L es un grupo de unión y T es un resto de unión a dianas.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado según la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de conjugación de amatoxina de fórmula I, en la que R1 a R4 son tal como se definieron anteriormente y en la que R5 = L-X; en el que L es un grupo de unión y X es un grupo saliente que puede remplazarse por un grupo nucleófilo de un resto de unión a dianas, particularmente una amina primaria.

Aún en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para sintetizar un conjugado de la presente invención, que comprende la etapa de hacer reaccionar una molécula de conjugación de amatoxina de la presente invención con un resto de unión a dianas que comprende un grupo nucleófilo, particularmente una amina primaria.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las fórmulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los números en negrita (de 1 a 8) designan la numeración convencional de los ocho aminoácidos que forman la amatoxina. También se muestran las designaciones convencionales de los átomos en los aminoácidos 1, 3 y 4 (las letras griegas de a a y, las letras griegas de a a y y los números desde 1 hasta 7, respectivamente).

La figura 2 muestra la actividad citotóxica de Her-DSC-3.378 [2.8] en una línea celular tumoral positiva para HER2 in vitro en un ensayo de BrdU tras incubación durante 72 h.

Descripción detallada de la invención

Antes que se describa a continuación la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en el presente documento ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de

describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que sólo estará limitado por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados entendidos comúnmente por un experto habitual en la técnica.

Preferiblemente, los términos usados en el presente documento se definen tal como se describen en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kólbl, H. eds. (1995), Helvética Chimica Acta, CH-41 Basilea, Suiza).

En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos,... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de amatoxina de fórmula I

Fórmula I

en la que:

R1 = H u OH;

R2 = H u OH;

R3 = NH2 u OH;

R4 = OH u O-alquilo C1-6; y

R5 = L-T; en el que L es un grupo de unión y T es un resto de unión a dianas.

2. Conjugado de amatoxina según la reivindicación 1, en el que el grupo de unión se conecta al resto de unión a dianas mediante un resto urea.

3. Conjugado de amatoxina según la reivindicación 2, en el que el resto de unión a dianas se conecta al grupo de unión L mediante un grupo amino presente en el resto de unión a dianas, en el que dicho grupo amino forma parte de dicho resto urea.

4. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que el grupo de unión tiene una longitud de entre 1 y 8 átomos, particularmente entre 1 y 6, más particularmente entre 1 y 4, y lo más particularmente entre 2 y 4 átomos.

5. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que el grupo de unión L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, opcionalmente sustituido.

6. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que el grupo de unión L comprende un resto seleccionado de uno de los siguientes restos: un resto disulfuro, éter, amina, éster, carboxamida, uretano y urea.

7. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que el resto de unión a dianas se une específicamente a un epítopo que está presente en una célula tumoral, particularmente en el que el resto de unión a dianas se une específicamente a un epítopo de una molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM).

8. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que el resto de unión a dianas se selecciona del grupo que consiste en:

(i) anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo; particularmente un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo seleccionado de: un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo desinmunizado, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano;

(ii) proteína similar a anticuerpo; y

(iii) aptámero de ácido nucleico.

9. Conjugado de amatoxina según la reivindicación 8, en el que el resto de unión a dianas es un fragmento de unión a antígenos seleccionado del grupo que consiste en Fab, F(ab)2, Fd, Fv, Fv de cadena sencilla y Fv con enlaces disulfuro (dsFv).

1. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso como medicamento.

11. Conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, particularmente en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de riñón, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.

12. Composición farmacéutica que comprende un conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y que comprende además uno o más diluyentes, portadores, excipientes, cargas, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes y/o conservantes farmacéuticamente aceptables.

13. Molécula de conjugación de amatoxina de fórmula I, en la que R1 a R4 son tal como se definen en la reivindicación 1; y en la que R5 = L-X; en el que L es un grupo de unión y X es un grupo saliente que puede remplazarse por un grupo nucleófilo de un resto de unión a dianas, particularmente en el que X es un grupo saliente que puede remplazarse por una amina primaria.

14. Molécula de conjugación de amatoxina según la reivindicación 13, en la que X se selecciona de: butiloxilo, -succinimidiloxilo, -1--succinimidiloxi-3-sulfonato (-sulfo-NHS), --(4-nitrofeniloxilo), --(3-nitrofeniloxilo), --(2,4- dinitrofeniloxilo), --(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxilo), -pentafluorofeniloxilo, -pentaclorofeniloxilo, --(2,4,5- triclorofeniloxilo), --(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-ilo), --(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3- dicarboximid-1-ilo), -1-ftalimidoiloxilo, -1-benzotriazoliloxilo, -1-(7-aza-benzotriazolil)oxilo y -N-imidazolilo.

15. Método para sintetizar un conjugado de amatoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la etapa de hacer reaccionar una molécula de conjugación de amatoxina según la reivindicación 13 ó 14 con un resto de unión a dianas que comprende un grupo nucleófilo, particularmente en el que dicho grupo nucleófilo es una amina primaria.