Composiciones de vacuna para la gripe estables a temperaturas de refrigerador.

Un método para preparar una composición de virus de gripe vivo estable en refrigerador,

método que comprende:

(a) clarificar una cosecha viral que comprende virus de gripe vivos por filtración, produciendo de ese modo una cosecha viral clarificada;

(b) someter la cosecha viral clarificada a centrifugación zonal continua, produciendo de ese modo una cosecha viral clarificada adicional;

(c) diluir y esterilizar por filtración estéril dicha cosecha viral clarificada adicional, produciendo de ese modo una cosecha viral esterilizada; y

(d) combinar la cosecha viral esterilizada con un estabilizante para obtener una concentración final de sacarosa al 6-8 % en peso/volumen (p/v), arginina al 1-2 % en p/v, ácido glutámico monosódico al 0,05-0,1 % en p/v e hidrolizado de gelatina al 0,5-2 %,

mediante lo cual se produce una composición de virus de gripe estable en refrigerador, cuya composición presenta una pérdida de potencia logarítmica inferior a 1,0 durante un periodo de 6 meses cuando se almacena de 4 ºC a 8 ºC.

Composiciones de vacuna para la gripe estables a temperaturas de refrigerador ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las vacunas frente a diversas y cambiantes cepas de gripe son importantes no solo desde un punto de vista de la de salud de la comunidad, sino también comercialmente, ya que cada año numerosos individuos se infectan con diferentes cepas y tipos de virus de la gripe. Los niños, los ancianos, los que no tienen una atención médica adecuada y las personas inmunocomprometidas tienen un riesgo especial de muerte por este tipo de infecciones. Un agravamiento del problema de las infecciones por gripe es que las cepas de gripe nuevas evolucionan rápidamente, necesitando por ello la producción continua de nuevas vacunas.

Se han producido numerosas vacunas capaces de producir una respuesta inmune protectora específica para este tipo de virus de la gripe diferentes durante más de 50 años e incluyen, por ejemplo, vacunas de virus completos, vacunas de virus fraccionados, vacunas de antígenos de superficie y vacunas con virus vivos atenuados. Sin embargo, aunque las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacunas son capaces de producir una respuesta inmune sistémica, las vacunas vivas atenuadas de virus también tienen la ventaja de ser capaces de estimular la inmunidad de la mucosa local en el tracto respiratorio. Por lo tanto es bastante deseable una vacuna que comprende un virus vivo atenuado que es capaz de producirse de forma rápida y económica y que es capaz de fácil almacenamiento/transporte. Incluso sería más deseable una vacuna tal que fuera capaz de almacenamiento/transporte a temperaturas de refrigerador (por ejemplo, aproximadamente 2-8 º C) .

Hasta la fecha, todas las vacunas contra la gripe disponibles en el mercado en Estados Unidos se han propagado en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus de la gripe crece bien en huevos de gallina, la producción de la vacuna depende de la disponibilidad de dichos huevos. Debido a que el suministro de huevos se debe organizar, y las cepas para la producción de vacunas se deben seleccionar meses antes de la siguiente temporada de gripe, la flexibilidad de este enfoque se puede limitar, y a menudo da como resultado retrasos y escasez en la producción y la distribución. Por lo tanto, se desean en gran medida métodos para aumentar la estabilidad (por ejemplo, a temperaturas de refrigerador) de la vacuna producida, ya que pueden prevenir el deterioro de las existencias de vacunas, que de otro modo necesitarían nueva producción, etc.

En los últimos años también se han desarrollado sistemas para producir virus de la gripe en cultivo celular (Véase, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of virus de la gripe in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen y Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151) ; por lo tanto, también se desea en gran medida cualquier método para aumentar la estabilidad de la composición de la vacuna (por ejemplo, almacenamiento/transporte a temperatura de refrigerador) en estos sistemas.

Los presentes inventores y colaboradores han realizado un trabajo considerable en la producción de virus de la gripe para la producción de vacunas; véase, por ejemplo, la solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/375.675 presentada el 26 de abril de 2002, documento de patente PCT/US03/12728 presentado el 25 de abril de 2003, documento Nº 10/423.828 presentado el 25 de abril de 2003, y documento de patente PCT/US05/017734 presentado el 20 de mayo de 2005.

La presente invención proporciona composiciones de vacuna que tienen estabilidad, por ejemplo, a temperaturas de refrigerador (por ejemplo, 4 º C) y métodos para producirlas. Los aspectos de la presente invención son aplicables a métodos de producción tradicionales de huevo de gallina y nuevas vacunas en cultivo celular (y también sistemas combinados) y comprenden otros numerosos beneficios que se harán evidentes después de la revisión de lo que sigue a continuación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para preparar una composición para la gripe adaptada al frío viva estable en refrigerador tal como se define en la reivindicación 1 y reivindicaciones que dependen de la misma.

La presente invención proporciona formulaciones líquidas de vacuna que son básicamente estables a temperaturas que varían de 4 º C a 8 º C. Estas y otras formulaciones líquidas, que son realizaciones específicas de la invención se denominan en el presente documento, por ejemplo, "formulaciones de vacuna de la invención", "formulaciones de vacuna estables en refrigerador", "formulaciones líquidas de la invención", "formulaciones de la invención", "formulaciones de la invención estables a temperatura de refrigerador (RTS) ", o simplemente "composiciones de la invención" o "composiciones de virus de la invención".

La presente invención enseñar formulaciones líquidas de vacuna que son básicamente estables a temperaturas que varían de 4 º C a 8 º C. En una realización específica de la invención, las formulaciones líquidas de vacuna de la invención son básicamente estables a temperaturas que varían de 4 º C a 8 º C o a 4 º C durante un periodo de 12

meses, o 18 meses, o 24 meses, o 36 meses, o 48 meses, en que existe una pérdida de potencia aceptable (por ejemplo, pérdida de potencia del virus de la gripe) , por ejemplo, una pérdida de potencia logarítmica entre 0, 5-1, 0, o potencia logarítmica inferior a 0, 5, o inferior a 1, 0, al final de tales periodos de tiempo.

En una realización, se proporcionan formulaciones de vacuna estables en refrigerador de la invención que comprenden virus de la gripe vivos. Por ejemplo, las formulaciones de la invención pueden comprender uno o más de los siguientes: un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío, un virus de la gripe sensible a la temperatura, un virus de la gripe sensible a la temperatura adaptado al frío atenuado, un virus de la gripe A, y un virus de la gripe B. En una realización, las formulaciones líquidas de vacuna de la invención comprenden dos cepas de virus de la gripe A y una cepa de virus de la gripe B.

La presente invención enseña adicionalmente composiciones inmunogénicas que comprenden formulaciones de la invención. La presente invención enseña adicionalmente vacunas (por ejemplo, vacunas de la gripe) que comprenden formulaciones y composiciones inmunogénicas de la invención.

La presente invención incluye adicionalmente métodos para producir tales formulaciones líquidas de vacuna. Por ejemplo, en una realización específica, en el presente documento se proporcionan métodos para producir formulaciones líquidas que comprenden uno o más virus de la gripe. En una realización específica, los métodos para producir una formulación líquida de la invención incluyen una o más de las siguientes etapas: 1) introducir una pluralidad de vectores [uno o más de los que incorporan (o codifican) una porción de un genoma del virus de la gripe] en una población de huevos huésped o en una población de células huésped, cuya población de huevos huésped o células huésped es capaz de apoyar la replicación de virus de la gripe; 2) cultivar la población de huevos huésped o población de células huésped a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha viral; 4) adición de un estabilizante (por ejemplo, soluciones que contienen sacarosa y glutamato tal como se describe en el presente documento) ; 5) clarificar la cosecha viral (por ejemplo, mediante filtración de profundidad o en membrana) , produciendo de ese modo una cosecha viral clarificada; 6) someter la cosecha viral a una etapa de centrifugación (por ejemplo, centrifugación zonal continua, centrifugación de flujo continuo) ; 7) una etapa de filtración estéril (por ejemplo, uso de filtro de 0, 2, o 0, 2-0, 5 micrómetros (con o sin calentamiento durante la filtración) ; y 8) almacenamiento a -60 grados C.

En otra realización específica, los métodos para producir una formulación líquida de la invención incluyen una o más de las siguientes etapas: 1) infección de una población de huevos huésped o en una población de células huésped con virus de la gripe; 2) cultivar la población de huevos huésped o población de células huésped a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha viral; 4) adición de un estabilizante; 5) clarificar la cosecha viral (por ejemplo, por filtración de profundidad y/o pasando a través de uno o más filtros que varían de 0, 2-0, 8 micrómetros; o 0, 8 o 1, 5 micrómetros seguido de... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una composición de virus de gripe vivo estable en refrigerador, método que comprende:

(a) clarificar una cosecha viral que comprende virus de gripe vivos por filtración, produciendo de ese modo una cosecha viral clarificada;

(b) someter la cosecha viral clarificada a centrifugación zonal continua, produciendo de ese modo una cosecha viral clarificada adicional;

(c) diluir y esterilizar por filtración estéril dicha cosecha viral clarificada adicional, produciendo de ese modo una 10 cosecha viral esterilizada; y (d) combinar la cosecha viral esterilizada con un estabilizante para obtener una concentración final de sacarosa al 6-8 % en peso/volumen (p/v) , arginina al 1-2 % en p/v, ácido glutámico monosódico al 0, 05-0, 1 % en p/v e hidrolizado de gelatina al 0, 5-2 %, mediante lo cual se produce una composición de virus de gripe estable en refrigerador, cuya composición presenta una pérdida de potencia logarítmica inferior a 1, 0 durante un periodo de 6 meses cuando se almacena de 4 º C a8 º C.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el virus de la gripe comprende uno o más de: un virus de la gripe adaptado al frío atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío sensible a la temperatura, un virus de la gripe 20 sensible a la temperatura atenuado, o un virus de la gripe sensible a la temperatura adaptado al frío atenuado.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el virus de la gripe comprende una estructura principal genética de uno o más de los siguientes virus de la gripe: A/Ann Arbor/6/60 y B/Ann Arbor/1/66.

4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en el que la cosecha viral se estabiliza a 2-8 º C mediante la adición de estabilizante antes de la clarificación en (a) .

5. El método de la reivindicación 4, en el que el estabilizante comprende sacarosa, fosfato y glutamato (SPG) .

6. El método de la reivindicación 5, en el que se añade el estabilizante de modo que se obtiene una concentración final de sacarosa 0, 2 M, fosfato 0, 01 M y glutamato 0, 005 M.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) por filtración de profundidad. 35

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) por filtración a través de un filtro de 5 μm.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) a 40 través de dos o más filtros.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) a través de un filtro que varía de 0, 2 micrómetros a 1, 5 micrómetros.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) por filtración a través de un filtro que varía de 0, 2 micrómetros a 0, 8 micrómetros.

12. El método de la reivindicación 10, en el que la cosecha viral se clarifica en (a) por filtración de profundidad a través de un filtro que varía de 0, 2 micrómetros a 0, 8 micrómetros. 50

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la centrifugación zonal continua se realiza sobre un gradiente de densidad de sacarosa.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el gradiente de densidad de sacarosa es en tampón fosfato. 55

15. El método de la reivindicación 13, en el que el gradiente de densidad de sacarosa es un gradiente de sacarosa al 10 %-60 % en tampón fosfato.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que el gradiente de sacarosa en tampón fosfato es a pH 7, 2. 60

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la centrifugación zonal continua se realiza a una temperatura de aproximadamente 2 º C a aproximadamente 8 º C.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se añade un diluyente que 65 comprende fosfato y glutamato a la cosecha viral clarificada adicional en la parte (c) .

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus clarificado adicional se diluye hasta una concentración de sacarosa 0, 2 M.

20. El método de la reivindicación 18 o 19, en el que el diluyente se añade a la cosecha viral clarificada adicional 5 hasta una concentración final de sacarosa 0, 2 M, fosfato 0, 1 M y glutamato 0, 005 M.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente en (d) mezclar la cosecha viral esterilizada con al menos una otra cosecha viral esterilizada, produciendo de ese modo una cosecha viral mezclada.

22. El método de la reivindicación 21, en el que la cosecha viral esterilizada se mezcla con otras dos cosechas virales esterilizadas, produciendo de ese modo una cosecha viral mezclada trivalente.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración final es sacarosa al

6-8 % en peso/volumen (p/v) ; arginina al 1-2 % en p/v; ácido glutámico monosódico al 0, 05-0, 1 % en p/v; hidrolizado de gelatina al 0, 5-2 % en tampón fosfato100 mM.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la concentración final es sacarosa al 6, 84

% en peso/volumen (p/v) , arginina al 1, 21 % en p/v, ácido glutámico monosódico al 0, 094 % en p/v, y hidrolizado de 20 gelatina al 1 %.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la dilución se realiza antes de la esterilización en la parte (c) .

26. El método de la reivindicación 1, que comprende formular la cosecha viral esterilizada, mediante la cual se produce una composición de virus de gripe adecuada para administración intranasal.

27. El método de la reivindicación 1, que comprende formular la cosecha viral esterilizada mediante la cual se produce una composición de virus de gripe adecuada para administración a un ser humano. 30

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición presenta una pérdida de potencia logarítmica inferior a 1, 0 durante un periodo de 12 meses cuando se almacena de 4 º C a 8 º C.