Cepas de levaduras manipuladas para producir etanol a partir de glicerol.

Una célula de levadura, que comprende:

a) un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil- CoA;

b) una modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula;

c) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de reducir acetil-CoA en acetaldehído; y

d) una modificación genética que aumenta la actividad específica de glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+.

Cepas de levaduras manipuladas para producir etanol a partir de glicerol

Campo de la invención La presente invención se refiere a la manipulación metabólica en microorganismos tales como levaduras. En particular, la invención se refiere a cepas de levadura que han sido manipuladas para producir etanol a partir de glicerol. Estas cepas han conservado su capacidad natural de producir etanol a partir de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.) y comprenden una capacidad de manipulación para producir etanol a partir de pentosas tales como xilosa. La invención se refiere, además, a los procesos en los que las cepas manipuladas de la invención producen etanol a partir de glicerol, ya sea como material de alimentación principal de la fermentación, o junto con una o más hexosas y pentosas.

Antecedentes de la invención Tanto la formación como la degradación de glicerol en la levadura Saccharomyces cerevisiae son procesos importantes que han sido estudiados durante más de un siglo. Durante las últimas décadas, se ha hecho hincapié en

(1) la supresión de la formación de glicerol durante la producción de etanol. A comienzos del siglo pasado (2) se ha estudiado la optimización de la producción de glicerol a partir de azúcares. Ambos aspectos tienen profundas repercusiones económicas. Más recientemente, se ha introducido un aspecto totalmente nuevo en este campo del glicerol. Se trata de (3) la fermentación anaerobia de glicerol en etanol.

(1) Supresión de la formación de glicerol durante la producción de etanol

El bioetanol es producido por Saccharomyces cerevisiae a partir de una variedad de sustratos, incluidos hidrolizados lignocelulósicos de materiales de alimentación no alimentarios (p. ej., cultivos energéticos y residuos agrícolas) . Uno de los problemas de la producción de etanol basada en levaduras es que durante la fermentación etanólica anaerobia de materiales de alimentación de azúcar, se forman invariablemente cantidades sustanciales de glicerol como un subproducto. La disimilación de azúcar durante el crecimiento anaerobio de S. cerevisiae se produce a través de la fermentación alcohólica. En este proceso, el NADH formado en la glucólisis se re-oxida a través de una alcohol deshidrogenasa NAD+-dependiente que convierte acetaldehído (formado por descarboxilación de piruvato) en etanol. Esta vía disimilatoria es redox neutra y, por lo tanto, no puede compensar una reducción neta de NAD+ en NADH que se produce en otros lugares en el metabolismo. Una reducción neta de este tipo de NAD+ en NADH se produce en asimilación cuando la biomasa de levadura se sintetiza en condiciones anaerobias a partir de azúcares y, p. ej., amoníaco. Bajo condiciones anaerobias, la re-oxidación de NADH en S. cerevisiae para compensar la formación de NADH asimilatoria-asociada depende principalmente de la reducción de al menos parte de la fuente de carbono de azúcar en glicerol, resultando un rendimiento menor de etanol. Para abordar este problema, se han explorado varias estrategias de manipulación metabólica para reducir o eliminar la producción de glicerol en S. cerevisiae desarrollada en condiciones anaerobias. Dos ejemplos son:

Nissen et al. (2000) describen una estrategia en la que se eliminó la enzima glutamato deshidrogenasa NADPHdependiente. Glutamina sintetasa y glutamato sintasa se sobre-expresaron. La cepa resultante ya no sintetizaba glutamato a partir de amonio y 2-oxoglutarato a través de una vía que requiere NADPH, sino más bien a través de una vía que requiere NADH y ATP. La cepa resultante tenía un rendimiento un 10% superior en etanol y un rendimiento un 38% inferior en glicerol que la cepa de tipo salvaje.

Guadalupe Medina et al. (2009, Appl. Environ. Microbiol, 76: 190-195) describen una cepa de S. cerevisiae en la que la producción del sub-producto glicerol se elimina por la interrupción de los genes glicerol 3-fosfato deshidrogenasa NAD-dependiente endógenos (GPD1 y GPD2) . La expresión del gen mhpF de E. coli que codifica la acetaldehído deshidrogenasa NAD-dependiente acetilante restauró la capacidad de la cepa disgregada con GPD de desarrollarse en condiciones anaerobias. Sin embargo, la cepa disgregada con GPD sólo podría desarrollarse en condiciones anaerobias si el medio se suplementa con ácido acético.

(2) Optimización de la producción de glicerol a partir de azúcares

Producción de glicerol a partir de azúcares, en contraposición a minimizar su producción durante la formación de etanol, ha sido un proceso económicamente importante durante la 1ª Guerra Mundial en Alemania. En los últimos años se observa un renovado interés en este proceso como lo demuestra, por ejemplo, el trabajo de Overkamp et al (2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 2814-21) .

(3) Fermentación de glicerol en etanol

La fermentación de glicerol en etanol no es factible en condiciones normales de S. cerevisiae y bajo condiciones de cultivo completamente anóxicas debido a un equilibrio desequilibrado de NADH. El glicerol se reduce más que el etanol y, por tanto, el organismo no puede deshacerse de su exceso de NADH por re-oxidación en condiciones anóxicas normales. Algún trabajo inicial se ha hecho en el campo de la fermentación de glicerol en etanol: Yu et al. (2010, Bioresour.Technol. 101 (11) : 4157-61. Epub 9 de febrero de 2010) describen cepas de S. cerevisiae metabólicamente manipuladas para mejorar la producción de etanol a partir de glicerol mediante la sobre-expresión simultánea de glicerol deshidrogenasa (GCY) , dihidroxiacetona quinasa (DAK) y la proteína de absorción de glicerol (GUP1) . En una comunicación posterior, Yu et al (2010, J. Biotechnol doi: 10.1016 / j.jbiotec.2010.09.932) describen una optimización de su cepa para la producción de etanol a partir de glicerol mediante la supresión de dos genes de producción de glicerol, FPS1 y GPD2. Se demostró que en sus cepas es posible la producción de etanol a partir de glicerol. Sin embargo, el aumento en el rendimiento dependía de las condiciones microaerobias, que puede explicarse por el requisito para la oxidación de NADH. El exceso de NADH producido en la vía a partir de glicerol a etanol al parecer sólo podría reoxidarse a través de una reacción dependiente de oxígeno.

Waks y Silver (2009, Appl. Environ. Microbiol, 75:1867-1875) describen un sistema de organismo dual sintético para la producción de biohidrógeno. En una primera etapa formiato es producido por una cepa manipulada de S. cerevisiae, en la que se ha implementado una vía super-productora de formiato. En una segunda etapa, el formiato producido por la levadura manipulada es procesado para formar hidrógeno por Escherichia coli. La cepa de S. cerevisiae se manipuló para producir formiato expresando la enzima piruvato formiato liasa (PFL) anaerobia de E. coli. La producción de formiato se incrementó aún más introduciendo también la expresión de una enzima de aguas abajo, la AdhE de E. coli, la enzima bifuncional que reduce acetil-CoA generada por PFL en etanol.

El documento WO 2010/019882 describe levaduras manipuladas genéticamente que son capaces de absorber glicerol y de convertir el glicerol en etanol.

Won-Kyung HONG et al., biotechnology letters vol. 32, nº 8, 2010, páginas 1077-1082 describen la producción mejorada de etanol a partir de glicerol por parte de Hansenula polymorpha manipulada que expresa genes piruvato descarboxilasa y aldehído deshidrogenasa de Zymomonas mobilis.

Es un objeto de la presente invención proporcionar para levaduras que sean capaces de producir etanol a partir de glicerol al tiempo que conserven sus capacidades de fermentación de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.) , así como pentosas tales como xilosa, así como procesos en los que estas cepas se utilizan para la producción de etanol y/u otros productos de la fermentación.

Descripción de la invención Definiciones La identidad de secuencia se define en esta memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos) , según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, tal como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos. Las expresiones "identidad de secuencia" o "similitud de secuencia"... [Seguir leyendo]

1. Una célula de levadura, que comprende:

a) un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil-CoA; b) una modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula;

c) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de reducir acetil-CoA en acetaldehído; y d) una modificación genética que aumenta la actividad específica de glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+.

2. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula comprende, además, una modificación genética seleccionada del grupo que consiste en:

a) una modificación genética que aumenta la capacidad específica de dihidroxiacetona quinasa;

b) una modificación genética que aumenta el transporte de glicerol a la célula; codificando un gen exógeno una enzima para la activación de la piruvato formiato liasa;

c) una modificación genética que aumenta la actividad de acetil-CoA sintetasa específica en la célula; y

d) una modificación genética que reduce la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula, al tiempo que la célula de levadura comprende una ruta de respuesta de glicerol de alta osmolaridad funcional.

3. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la célula comprende al menos uno de:

i) un gen xilosa isomerasa exógeno, gen que confiere a la célula la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa; y

ii) genes exógenos que codifican una L-arabinosa isomerasa, una L-ribuloquinasa y una L-ribulosa-5— fosfato 4-epimerasa, genes que juntos confieren a la célula la capacidad de convertir L-arabinosa en Dxilulosa 5-fosfato.

4. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde al menos uno de:

a) la modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula comprende la inactivación de al menos una copia endógena de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa en el genoma de la célula;

b) la modificación genética que aumenta la actividad específica de la glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+ es la expresión de un gen heterólogo que codifica una glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+;

c) la modificación genética que aumenta el transporte del glicerol a la célula es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de una proteína de absorción de glicerol y un canal de glicerol; y

d) la modificación genética que reduce la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula comprende la inactivación de al menos una copia endógena de un gen que codifica una glicerol 3-fosfato deshidrogenasa en el genoma de la célula; y

e) la modificación genética que aumenta la actividad de acetil-CoA sintetasa específica es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa; y

f) la modificación genética que aumenta la actividad específica de dihidroxiacetona quinasa es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa.

5. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:

a) el gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 57% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1;

b) el gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 3;

c) el gen que codifica una formiato deshidrogenasa, cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al

menos 70% de identidad de secuencia con al menos una de SEQ ID NO: 5 y 6;

d) el gen exógeno que codifica la enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos uno de:

i) al menos 64% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 7,

ii) al menos 76% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 9 y

iii) al menos 61% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 11;

e) la secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+ comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 49,

f) la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 14, 15 y 52:

g) la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una SEQ ID NO: 16 y 17, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el canal de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 30% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de SEQ ID NO: 18;

h) la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NOs: 19 y 20; e i) el gen que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa, cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es un gen que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21, mientras que la célula tiene al menos una copia funcional de un gen endógeno que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 22.

6. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la célula de levadura comprende al menos una modificación genética adicional que resulta en una característica seleccionada del grupo que consiste en:

a) actividad específica para xilulosa quinasa incrementada;

b) flujo incrementado de la vía de pentosa fosfato c) actividad específica para reductosa aldosa inespecífica reducida d) transporte incrementado de al menos una de xilosa y arabinosa a la célula huésped;

e) sensibilidad disminuida a la represión de catabolitos; f) tolerancia incrementada a etanol, osmolaridad o ácidos orgánicos; y

g) producción reducida de sub-productos.

7. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula de levadura es de un género seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia.

8. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula de levadura pertenece a una especie seleccionada del grupo que consiste en S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombes.

9. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos una de las secuencias de nucleótidos codificadoras de la enzima con actividad de piruvato formiato liasa, la enzima con actividad de piruvato formiato liasa, la enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, la xilosa isomerasa, la L-arabinosa isomerasa, la L-ribuloquinasa y la L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa es una secuencia de nucleótidos, cuyo uso de codones ha sido optimizado para la expresión en la célula de levadura.

10. Un procedimiento para producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1, 3-propanodiol, un butanol y un producto derivado de isoprenoides, en donde el procedimiento comprende las etapas de:

a) fermentar un medio con una célula de levadura según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el medio contiene o es alimentado con una fuente de glicerol y con una fuente de al menos una de una hexosa y una pentosa, en donde la célula de levadura fermenta el glicerol y la al menos una de la hexosa y pentosa para dar el producto de fermentación y formiato; y, opcionalmente,

b) recuperar al menos uno del producto de fermentación y formiato.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el producto de fermentación es etanol.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que el medio contiene o es alimentado con un hidrolizado lignocelulósico.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la célula de levadura fermenta en condiciones anaerobias.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el pH del medio se regula durante el proceso de fermentación para mantener una concentración de ácido fórmico no disociado que no es mayor que 20, 0 mM.