Biblioteca a partir de toxinas mutantes y procesos de utilización de la misma.

Biblioteca combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies de proteínas,

comprendiendo cada especie de proteína una cadena A de una proteína de toxina I del tipo Shiga modificada mediante la mutación del aminoácido Cys242 y/o Cys261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, comprendiendo la cadena A modificada además un bucle sensible a proteasa tal como se define con referencia a los aminoácidos 242 a 261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, en la que se ha introducido un inserto, comprendiendo el inserto un polipéptido de una secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 3 a 200 residuos de aminoácidos.

Biblioteca a partir de toxinas mutantes y procesos de utilización de la misma Antecedentes de la invención

[1] La presente solicitud se refiere a bibliotecas de mutantes de toxinas, y a procedimientos de uso de las mismas en el desarrollo de agentes terapéuticos dirigidos contra tipos de células específicas.

[2] Las toxinas vegetales y bacterianas tienen una organización estructural con dos o más dominios o subunidades de polipéptidos responsables de distintas funciones, referidas como Ay B. Las toxinas pueden referirse como toxinas ABX, donde x representa el número de subunidades B idénticas u homologas en la toxina. Esta familia de toxinas relacionadas con la estructura incluye ejemplos, tales como Shlga y toxinas similares a Shiga, las enterotoxinas termolábiles de E. coli, la toxina del cólera, la toxina de la difteria, la toxina pertussis, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (Olsnes, S. y Sandvik, K. (1988) en Inmunotoxlns pág. 39-73, Kluwer Academic, Boston; Sandvik, K., Dubinina, E., Garred, O., et al. (1992) Biochem. Soc. Trans. 2:724), así como toxinas vegetales, tales como ricina y abrina. En algunos casos las toxinas son heterómeras, en las que las cadenas B son en realidad entidades separadas que se conectan a la cadena A de la toxina a través de una unión no covalente. En otros casos, la toxina es monomérica, puesto que la cadena B forma parte de la misma proteína cuando la toxina se produce en la naturaleza. En muchos casos, la cadena Ase ha caracterizado por tener dos dominios, un dominio de A1 y un dominio A2.

[3] En base a su capacidad de bloquear la síntesis de proteínas, las proteínas, tales como toxinas de Shiga y toxinas similares a Shiga, así como ricina, abrina, gelonina, crotina, proteína antiviral de fitolaca, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina de la difteria y exotoxina A se han referido como proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP). La potencia de las RIP es extremadamente alta; una molécula de la cadena A de la toxina de la difteria (Yamaizumi, et al. (1978) Cell 15:245-25) o la cadena A de ricina (Eiklid, et al. 198) Exp. Cell. Res 126:321-326) se ha demostrado que es suficiente para matar una célula eucariota.

[4] La publicación de patente internacional N° WO99/4185 describe bibliotecas de toxinas mutantes en las que las mutaciones se introducen en el dominio de unión para alterar el tipo de células a las que se liberan las especies tóxicas. Las nuevas proteínas se derivatizan mutando una subunidad de unión de la proteína cltotóxlca de la proteína heterómera de tipo salvaje para crear una biblioteca de clones de microorganismos que producen proteínas mutantes, que a continuación se criban para detectar la capacidad de unirse específicamente y matar un tipo de célula diana.

[5] La patente de EE.UU. N 5.552.144 da a conocer una variante de toxina II de tipo Shlgella variante a la que se introduce una mutación en la cadena A en la posición 167 para cambiar el aminoácido en esta posición por uno con una carga diferente. Esto dio como resultado una toxina con menos actividad enzimática asociada con la toxicidad.

[6] La patente de EE.UU. N° 6.593.132 describe proteínas tóxicas recombinantes que son específicamente tóxicas para células enfermas, pero no dependen para su especificidad de acción de un componente específico de unión a células. Las proteínas recombinantes de la patente '132 tienen una cadena A de una toxina de tipo ricina unida una cadena B mediante una secuencia enlazadora sintética que puede ser escindida específicamente por una proteasa localizada en las células o tejidos afectados por una enfermedad específica para liberar la cadena A tóxica, inhibiendo o destruyendo así de manera selectiva las células o tejidos enfermos.

[7] La patente de EE UU. N° 6.649.742 da a conocer proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP) de tipo I y análogos de las RIP que tienen una cisteína disponible para la unión disulfuro a moléculas diana. Las RIP y análogos de RIP se utilizan como componentes de agentes terapéuticos citotóxicos para eliminar selectivamente cualquier tipo de célula a la que el componente RIP está dirigido por la capacidad de unión específica del segundo componente del agente.

[8] La solicitud PCT PCT/CA24/433 de los presentes inventores da a conocer bibliotecas combinatorias de proteínas que comprenden una pluralidad de especies de proteínas, en las que cada especie de proteína comprende una cadena A de una proteína tóxica heterómera, en la que se ha introducido un inserto.

[9] Bray et al. Current biology, vol. 11(9) 1 Mayo 211, páginas 697-71, describe el sondeo de la superficie de células eucariotas utilizando las bibliotecas combinatorias de toxinas.

[1] Perampalan et al., Molecular and Cellular Proteomics, Vol. 2(9), 11 enero 23, página 868, describe el diseño de bibliotecas combinatorias de proteínas en base a una plantilla de toxinas de proteínas.

[11] Lacy et al. current Opinión ¡n Structural Biology, Vol 8(6), Dlc. 1998, páginas 778-784, describe la rsolución de la estructuras y modos de acción de toxinas bacterianas.

[12] Un aspecto de la presente invención es una biblioteca combinatoria de proteínas tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una pluralidad de especies de proteínas, comprendiendo cada especie de proteína una cadena A de una proteína de toxina 1 del tipo Shiga en la que se ha introducido un inserto, en la que, (a) el inserto es un polipéptido de una secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 3-2 residuos de aminoácidos; y (b) el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. En una realización adicional, la biblioteca puede comprender hasta o más de 1 especies de proteínas. El inserto se introduce en la cadena IA de la toxina de tipo Shiga entre los aminoácidos 242 y 261, tal como entre los aminoácidos 245 y 246.

[13] En una realización adicional de la presente invención, el inserto tiene una longitud de 7 aminoácidos.

[14] Otro aspecto de la presente invención es una proteína mutante tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una cadena A de una proteína de toxina 1 del tipo Shiga en la que se ha introducido un inserto, en el que el inserto es un polipéptido de secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 3-2 residuos de aminoácidos; y el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se introduce entre los aminoácidos 242 y 261, tales como entre los aminoácidos 245 y 246.

[15] Un aspecto adicional descrito en el presente documento es un procedimiento para identificar un ligando que se une a una diana/receptor específico, que comprende las etapas de exponer las células que se sabe que poseen la diana/receptor a los miembros de una biblioteca combinatoria de proteínas tal como se describe en el presente documento; seleccionar los miembros de la biblioteca de proteínas que se observa que son tóxicos para las células; evaluar los miembros seleccionados de la biblioteca de proteínas para determinar la secuencia de la región insertada, mediante lo cual se identifica un péptido de la secuencia de la región insertada como un posible ligando para una diana/receptor en la célula; y adicionalmente probar péptidos de la secuencia de la región insertada para confirmar que son un ligando para la diana/receptor específico.

[16] Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento, tal como se define en las reivindicaciones, para aislar una toxina específica para una diana/receptor conocido que comprende las etapas de: exponer la diana/receptor a una biblioteca combinatoria de proteínas tal como se define en las reivindicaciones; y aislar al menos una especie de proteína de la biblioteca combinatoria de proteínas capturada mediante la unión a la diana/receptor.

[17] Un aspecto adicional de la presente invención es una biblioteca combinatoria de proteínas, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una pluralidad de especies de proteínas, comprendiendo cada especie de proteína una cadena A modificada de una proteína de toxina 1 del tipo Shiga en la que se ha introducido un inserto, en el que la cadena A modificada comprende una cadena A de tipo salvaje que contiene una mutación en al menos una cisteína (tal como se define en las reivindicaciones); el inserto es un polipéptido de secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 2-3 residuos de aminoácidos; y el inserto se introduce en la región que sería un bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A de tipo salvaje.

[18] Un aspecto adicional de la presente invención es una proteína mutante, tal como se define en las reivindicaciones,... [Seguir leyendo]

1. Biblioteca combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies de proteínas, comprendiendo cada especie de proteína una cadena A de una proteína de toxina I del tipo Shiga modificada mediante la mutación del aminoácido Cys242 y/o Cys261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, comprendiendo la cadena A modificada además un bucle sensible a proteasa tal como se define con referencia a los aminoácidos 242 a 261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, en la que se ha introducido un inserto, comprendiendo el inserto un polipéptido de una secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 3 a 2 residuos de aminoácidos.

2. Biblioteca combinatoria de proteínas, según la reivindicación 1, en la que la cadena A modificada comprende un residuo de cisterna y comprende además un marcador o sonda unidos al residuo de cisteína.

3. Biblioteca combinatoria de proteínas, según la reivindicación 1 ó 2, en la que la mutación en al menos una cisteína es una mutación de cisteína a una alanina.

4. Biblioteca combinatoria de proteínas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la especie de proteína se forma mediante la introducción de un inserto entre los aminoácidos 245 y 246, tal como se define con referencia a la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A.

5. Biblioteca combinatoria de proteínas, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inserto tiene una longitud de 7 aminoácidos.

6. Proteína muíante que comprende una cadena A de una proteína de toxina I del tipo Shiga modificada mediante la mutación del aminoácido Cys242 y/o Cys261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, comprendiendo la cadena A modificada además un bucle sensible a proteasa tal como se define con referencia a los aminoácidos 242 a 261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, en la que se ha introducido un inserto, comprendiendo el inserto un polipéptido de una secuencia de aminoácidos variante que tiene una longitud de 3 a 2 residuos de aminoácidos.

7. Proteína muíante, según la reivindicación 6, en la que la mutación en al menos una cisteína es una mutación de cisteína a una alanina.

8. Proteína muíante, según la reivindicación 6, en la que el inserto se introduce entre los aminoácidos 245 y 246, tal como se define con referencia a la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A.

9. Proteína muíante, según la reivindicación 8, en la que el inserto comprende la secuencia IYSNKLM.

1. Proteína muíante, según la reivindicación 8, en la que el inserto comprende la secuencia AAFADLI.

11. Procedimiento para aislar una toxina específica para una diana/receptor, que comprende las etapas de:

(a) exponer la diana/receptor a una biblioteca combinatoria de proteínas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y

(b) aislar al menos una especie de proteína de la biblioteca combinatoria de proteínas capturada mediante la unión a la diana/receptor.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, que comprende además la etapa de cribar la proteína aislada frente a células que expresan la diana/receptor, para confirmar su toxicidad para células que expresan la diana/receptor.

13. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que la diana/receptor es una diana/receptor purificado y está inmovilizado sobre un soporte sólido.

14. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que la diana/receptor está sobre la superficie de las células.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el que las células están inmovilizadas sobre un soporte sólido.

16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la toxina sirve como reportera, y la muerte de las células es indicativa de la unión a un receptor.

17. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que las células son células cancerosas.

18. Biblioteca combinatoria de proteínas, según la reivindicación 2, en la que la cadena A modificada es una cadena A modificada de la toxina I del tipo Shiga, y en la que los marcadores o sondas se seleccionan del grupo que consiste en marcadores o sondas espectroscópicas, radioactivas y bioquímicas.

19. Biblioteca combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies de proteínas, comprendiendo

cada especie de proteína una cadena A de una proteína de toxina I del tipo Shiga modificada mediante la mutación del aminoácido Cys242 y/o Cys261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, comprendiendo la cadena A modificada además un bucle sensible a proteasa tal como se define con referencia a los aminoácidos 242 a 261 de la secuencia mostrada en la figura 14A, figura 14C o figura 15A, en la que se ha 5 introducido un inserto, consistiendo el inserto en una secuencia de dominio variable de una molécula Fe.