Una colección combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies proteicas,

comprendiendo cada especie proteica una cadena A de una proteína tóxica ABx que puede ser escindida por una proteasa en la que se ha introducido un inserto, y en la que

(a) el inserto es un polipéptido con una secuencia variable de aminoácidos que tiene una longitud de al menos 2 restos de aminoácido; y

(b) el inserto se introduce en un bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A

Colección de mutantes de toxinas y métodos para su uso.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud se refiere a colecciones de mutantes de toxinas, y a métodos para usar las mismas en el desarrollo de agentes terapéuticos dirigidos contra tipos celulares específicos.

Las toxinas vegetales y bacterianas tienen una organización estructural con dos o más dominios o subunidades polipeptídicas responsables de distintas funciones, denominadas A y B. Las toxinas pueden denominarse toxinas ABx donde x representa el número de subunidades B idénticas u homólogas en la toxina. Esta familia de toxinas relacionadas incluye ejemplos tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, las enterotoxinas sensibles al calor de E. coli, la toxina del cólera, la toxina de la difteria, la toxina pertussis, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (Olsnes, S. y Sandvik, K. (1988) en Immunotoxins pp. 39-73, Kluwer Academic, Boston; Sandvik, K., Dubinina, E., Garred, O., et al. (1992) Biochem. Soc. Trans. 20:724) así como toxinas vegetales tales como ricina y abrina. En algunos casos las toxinas son heterómeras, en las que las cadenas B son en realidad entidades separadas que se conectan con la cadena tóxica A mediante un enlace no covalente. En otros casos, la toxina es monomérica, puesto que la cadena B forma parte de la misma proteína cuando la toxina se produce en la naturaleza.

Basándose en su capacidad para bloquear la síntesis de proteínas, las proteínas tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, así como la ricina, abrina, gelonina, crotina, proteína antiviral de fitolaca americana, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina de la difteria y exotoxina A se han denominado proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP, del inglés "ribosome-inactivating proteins"). La potencia de las RIPs es extremadamente alta, habiéndose demostrado que una molécula de la cadena A de la toxina de la difteria (Yarnaizumi, et al. (1978) Cell 15:245-250) o de la cadena A de la ricina (Eiklid, et al. (1980) Exp. Cell Res. 126:321-326) es suficiente para destruir una célula eucariótica.

La Publicación de Patente Internacional Nº WO99/40185 describe colecciones de toxinas mutantes en las que las mutaciones se introducen en el dominio de unión para alterar el tipo de células al que se suministran las especies tóxicas. Las nuevas proteínas se derivan mutando una subunidad de unión de la proteína citotóxica heterómera salvaje para crear una colección de clones de microorganismos que producen proteínas mutantes que a continuación se someten a escrutinio sobre la base de su capacidad para unirse y destruir específicamente un tipo celular diana.

La Patente de los EEUU N° 5,552,144 describe una variante de la toxina II de tipo Shigella en la que se introduce una mutación en la cadena A en la posición 167 para cambiar el aminoácido en esta posición por uno con diferente carga. Esto dio como resultado una toxina con menor actividad enzimática asociada con la toxicidad.

La Patente de los EEUU N° 6,593,132 describe proteínas tóxicas recombinantes que son tóxicas específicamente para células enfermas, pero que no dependen para su especificidad de acción de un componente específico de unión a la célula. Las proteínas recombinantes de la patente '132 tienen una cadena A de una toxina de tipo ricina enlazada a una cadena B mediante una secuencia de enlace sintética que puede ser escindida específicamente por una proteasa localizada en las células o tejidos afectados por una enfermedad específica para liberar la cadena tóxica A, inhibiendo o destruyendo así selectivamente las células o tejidos enfermos.

La Patente de los EEUU N° 6,649,742 describía proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) de Tipo I y análogos de RIPs que tienen una cisteína disponible para formar un puente disulfuro con moléculas diana. Las RIPs y los análogos de RIPs se usan como componentes de agentes terapéuticos citotóxicos para eliminar selectivamente cualquier tipo celular al que se dirija el componente RIP mediante la capacidad de unión específica del segundo componente del agente.

Compendio de la invención

La presente proporciona colecciones combinatorias de proteínas que comprenden una pluralidad de especies proteicas, en las que cada especie proteica comprende una cadena A de una proteína tóxica heterómera AB_x en la que se ha introducido un inserto. Según la invención, el inserto es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos variable que tiene una longitud de 2 o más restos de aminoácido, por ejemplo de 3 a 200 restos de aminoácido, y el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El resultado de la introducción del inserto crea un dominio de unión artificial dentro de la cadena A, de tal forma que la cadena A desarrolla una especificidad tóxica que es independiente y diferente de la especificidad normal asociada con los dominios de unión de las cadenas B. El escrutinio de la colección permite la selección e identificación de toxinas mutantes que son específicas para tipos celulares diferentes, incluyendo tipos de células cancerosas. En una realización de la invención, la colección combinatoria comprende especies proteicas que se forman introduciendo el inserto en la cadena A de una toxina I de tipo Shiga, por ejemplo en la región entre los aminoácidos 242 y 261, como se define con referencia a la Sec. ID Nº 1.

La invención proporciona también una colección combinatoria de expresión que comprende una pluralidad de especies de sistemas de expresión, expresando cada especie una especie proteica que comprende una cadena A de una proteína tóxica heterómera AB_x en la que se ha introducido el inserto como se describe anteriormente. La expresión de proteínas a partir de la colección combinatoria de expresión da como resultado la formación de una colección combinatoria de proteínas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición para tratar melanoma, y métodos para usar tal composición. La composición comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una proteína tóxica heterómera AB_x en la que un polipéptido que tiene una longitud de 2 o más restos de aminoácido, por ejemplo de 3 a 200 restos de aminoácido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad tóxica frente a las células del melanoma. La especie proteica se usa en el tratamiento del melanoma administrándola al paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente como para producir la reducción del número de células de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición para tratar otros tipos de cáncer. La composición comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una proteína tóxica heterómera AB_x en la que un polipéptido que tiene una longitud de 2 o más restos de aminoácido, por ejemplo de 3 a 200 restos de aminoácido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad tóxica frente a las células cancerosas. En una realización específica, el inserto se selecciona para unirse a receptores MUC-1. La especie proteica se usa en el tratamiento del melanoma administrándola al paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente como para producir la reducción del número de células de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar ligandos que se unen a dianas/recep-tores específicos, tales como los marcadores tumorales que se sabe que existen en las células cancerosas. En este método, la toxina de la colección combinatoria sirve como reportero, y una colección combinatoria de proteínas según la invención se somete a escrutinio frente a células que se sabe que poseen la diana/receptor. Las proteínas que presentan toxicidad frente a las células se evalúan para determinar la secuencia de la región insertada. Los péptidos con esta secuencia pueden usarse seguidamente, en combinación con una toxina u otras moléculas, para dirigir compuestos a las células que poseen la diana/receptor.

En otro aspecto adicional más de la invención, se proporciona un método para identificar sustancias tóxicas específicas para un marcador celular conocido. En esta realización de la invención, la toxina no necesita servir como reportero. Por tanto, las células que tienen el marcador, o una diana/receptor...

1. Una colección combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie proteica una cadena A de una proteína tóxica AB_x que puede ser escindida por una proteasa en la que se ha introducido un inserto, y en la que

(a) el inserto es un polipéptido con una secuencia variable de aminoácidos que tiene una longitud de al menos 2 restos de aminoácido; y

(b) el inserto se introduce en un bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A.

2. La colección combinatoria de proteínas de la reivindicación 1, en la que la colección comprende al menos 100 especies proteicas.

3. La colección combinatoria de proteínas de la reivindicación 1 ó 2, en la que las especies proteicas se forman introduciendo el inserto en la cadena A de una toxina I de tipo Shiga.

4. La colección combinatoria de proteínas de la reivindicación 3, en la que la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoácidos 242 y 261, como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

5. La colección combinatoria de proteínas de la reivindicación 4, en la que la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoácidos 245 y 246, como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

6. La colección combinatoria de proteínas de la reivindicación 3, en la que la especie proteica se forma introduciendo el inserto antes o después de los aminoácidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga, como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

7. La colección combinatoria de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el inserto tiene una longitud de 7 aminoácidos.

8. Una colección combinatoria de expresión que comprende una pluralidad de especies de sistemas de expresión, expresando cada especie una especie proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una proteína mutante que comprende una cadena A de una proteína tóxica AB_x en la que se ha introducido un inserto, y en la que

(a) el inserto es un polipéptido con una secuencia variable de aminoácidos que tiene una longitud de al menos 2 restos de aminoácido; y

(b) el inserto se introduce en un bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A, en el que el inserto tiene afinidad de unión hacia una diana o receptor celular.

10. La proteína mutante de la reivindicación 9, en la que la cadena A de una proteína tóxica es la cadena A de una toxina I de tipo Shiga.

11. La proteína mutante de la reivindicación 10, en la que el inserto se introduce entre los aminoácidos 242 y 261 como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

12. La proteína mutante de la reivindicación 11, en la que el inserto se introduce entre los aminoácidos 245 y 246 como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

13. La proteína mutante de la reivindicación 12, en la que el inserto comprende la secuencia IYSNKLM (SEC ID N° 6).

14. La proteína mutante de la reivindicación 12, en la que el inserto comprende la secuencia AAFADLI (SEC ID N° 7).

15. La proteína mutante de la reivindicación 10, en la que el inserto se introduce antes o después de los aminoácidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga como se define con referencia a la SEC ID N° 1.

16. La proteína mutante de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en la que el inserto tiene una longitud de 7 aminoácidos.

17. Un método para identificar un ligando que se une a una diana/receptor, que comprende los pasos de:

(a) exponer células que se sabe que poseen una diana/receptor a los miembros de una colección combinatoria de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(b) seleccionar los miembros de la colección de proteínas que se observa que son tóxicos para las células, mediante lo cual se usa una región insertada en un miembro seleccionado que se observa que es tóxico para identificar un posible ligando para una diana/receptor de la superficie celular en la célula.

18. Un método para aislar una toxina específica para una diana/receptor conocido que comprende los pasos de:

(a) exponer una diana/receptor conocido a una colección combinatoria de proteínas conocida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(b) aislar al menos una especie proteica de la colección combinatoria de proteínas capturada por unión a la diana/receptor.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende además el paso de someter a escrutinio la proteína aislada frente a células que expresan la diana/receptor para confirmar su toxicidad hacia las células que expresan la diana/receptor.

20. El método de la reivindicación 18, en el que la diana/receptor es una diana/receptor purificado y se inmoviliza sobre un soporte sólido.

21. El método de la reivindicación 20, en el que la diana/receptor está en la superficie de las células.

22. El método de la reivindicación 21, en el que las células se inmovilizan sobre un soporte sólido.

23. El método de la reivindicación 21 ó 22, en el que la toxina sirve como reportero, y la muerte de las células es indicativa de la unión al receptor.

24. La colección combinatoria de proteínas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el inserto tiene una longitud de 3 a 200 aminoácidos.

25. La colección combinatoria de proteínas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que al menos un inserto tiene afinidad de unión por una célula diana o receptora.

26. El método de la reivindicación 17, que comprende además el paso de evaluar los miembros seleccionados de la colección de proteínas para determinar la secuencia de la región insertada, mediante lo cual se identifica un péptido con la secuencia de la región insertada como posible ligando para una diana/receptor de la superficie celular en la célula.

27. El método de la reivindicación 26, que comprende además el paso de ensayar los péptidos con la secuencia de la región insertada para confirmar que son un ligando para la diana/receptor de la superficie celular.

28. El método de la reivindicación 17, que comprende además el paso de identificar la diana/receptor de la superficie celular que se une al ligando.