Beta-glucanasas de Talaromyces emersonii.

Un polipéptido, que es una Beta-glucanasa obtenible de un hongo del género Talaromices,

tal como el hongo Talaromices emersonii, que tiene la actividad EC 3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2001/003174.

Solicitante: BASF SE.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: 67056 LUDWIGSHAFEN ALEMANIA.

Inventor/es: VAN DER LAAN, JAN METSKE, HERWEIJER, MARGARETA, ADRIANA, VAN DEN HOMBERGH,JOHANNES PETRUS THEODORUS, DARAN,JEAN-MARC GEORGES, TEUFEL,DANIEL PAUL.

Fecha de Publicación: 26 de Febrero de 2014.

Clasificación Internacional de Patentes:

A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
A23K1/165
A61K38/00 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
A61K38/47 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. celulosas, lactasas.
A61P3/06 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 3/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos del metabolismo (de la sangre o de fluido extracelular A61P 7/00). › Antihiperlipidémicos.
C12N1/15 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/56 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
C12N9/24 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
C12P19/14 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa.

PDF original: ES-2299486_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

β-glucanasas de Talaromices emersonii.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con (β-)glucanasas novedosas (y también con celulasas) del hongo Talaromices, en particular Talaromices emersonii, y su uso para degradar glucan en celulosa.

Antecedentes de la invención

La composición de una pared de célula vegetal es compleja y variable. Los polisacáridos se encuentran principalmente en la forma de cadenas largas de celulosa (el componente estructural principal de la pared celular vegetal), hemicelulosa (que comprende varias cadenas de β-xilano, tales como xiloglucanos) y pectina.

El beta-glucano (o, más propiamente, (1rightarrow3)(1rightarrow4)β-D-glucan), PM 10 a 14 kDa, es un componente de hemicelulosa vegetal (PM de aproximadamente 700 kDa) y consiste de una estructura de residuos de glucopiranosa β-1,4 y 1,3 ligados. Otro componente es el xilano que consiste de residuos de xilosa β-1,4 ligados, opcionalmente sustituidos con cadenas laterales tales como arabinosa y/o residuos de ácido glucurónico.

Existen diferencias básicas entre monocotiledones (por ejemplo, cereales y pastos) y dicotiledones (por ejemplo, trébol, colza y soja) y entre la semilla y partes vegetativas de la planta. Los monocotiledones se caracterizan por la presencia de un complejo de arabinoxilano como la estructura hemicelulosa principal, y la estructura principal de hemicelulosa en dicotiledones es un complejo de xiloglucano. Mayores concentraciones de pectina se encuentran en los dicotiledones que en los monocotiledones. Las semillas son generalmente altas en sustancias pécticas pero relativamente bajas en material celulósico.

Las enzimas que degradan la celulosa se utilizan para procesar material vegetal en alimentos así como también aplicaciones de alimento o como aditivos de comida o alimento debido a su capacidad de actuar sobre los sustituyentes principales de la pared celular de la planta.

La mayoría de las enzimas que degradan la celulosa disponibles para la industria parecen ser las glucanasas con un peso molecular relativamente bajo y una estabilidad moderada a temperaturas altas. MOLONEY A. P. et al. (BIOCHEMICAL JOURNAL, Vol. 225, No. 2. 1985, páginas 365-374) describe cuatro endo-Glucanasas de T. emersonii que muestran una actividad óptima a un pH de 5,5 a 5,8 y a una temperatura de 75ºC a 70ºC. Sin embargo, para ciertas aplicaciones es deseable utilizar una glucanasa con una termoestabilidad relativamente alta. Si la glucanasa se va a utilizar como un aditivo de alimento animal se prefiere entonces la alta termoestabilidad en razón de las condiciones de alta temperatura aplicadas durante el apelmazado del alimento animal.

Resumen de la invención

Se suministran ahora β-glucanasas novedosas (o celulasas) que son capaces de dividir β-D-glucano (o celulosa) tal como está presente en el material vegetal.

Se suministra un polipéptido, el cual es una β-glucanasa obtenible de un hongo del género Talaromices, tal como el hongo Talaromices emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa) que comprende:

(i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No.2; o
(ii) una variante de (i) que es capaz de dividir el β-D-glucano que tiene por lo menos 70% de identidad sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 2 o por lo menos 80% sobre una región de por lo menos 150 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2; o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir β-D-glucano.

En su aspecto más amplio, la invención se relaciona con β-glucanasas (o celulasas) de Talaromices, tales como Talaromices emersonii (un hongo). Estas β-glucanasas pueden dividir el β-D-glucano o celulosa, por ejemplo ellas son β-1,4-endoglucanasas, o tienen la actividad EC 3.2.1.4.

Las glucanasas pueden tener:

a. un pH óptimo por debajo de 7,0 o 5,4, tal como 5,0, por ejemplo, 4,4 a 5,2 o desde 3,0 a 6,0 o 7,0; o
b. una temperatura óptima de por lo menos 72ºC, 75ºC o aún 81ºC, tal como desde 78ºC a 85ºC o desde 83ºC a 87ºC.

Más específicamente, la presente invención suministra un polipéptido de β-glucanasa (aislado) que comprende:

(i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 2; o
(ii) una variante de (i) que es capaz de dividir β-D-glucano; o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir β-D-glucano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se suministra un polinucleótido que comprende:

(a) la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1, o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;
(b) una secuencia que es complementaria a, o que hibrida bajo condiciones de exigencia alta, una secuencia como se define en (a) sobre la longitud completa;
(c) un fragmento de cualquier secuencia en (a) o (b);
(d) una secuencia que tiene por lo menos 75%, preferiblemente 80%, de identidad con cualquier secuencia como se define en (a); o
(e) una secuencia que se degenera como resultado del código genético de cualquiera de las secuencias como se define en (a).

La invención también suministra:

- un vector (por ejemplo, expresión) que comprende un polinucleótido de la invención y el cual puede ser capaz de expresar un polipéptido de la invención;
- una línea celular o cepa que comprende un vector de la invención;
- un método para producir un polipéptido de la invención cuyo método comprende mantener una línea celular o cepa de la invención bajo condiciones adecuadas para obtener la expresión del polipéptido y, si es necesario, aislar el polipéptido;
- un método para degradar β-D-glucano, el método comprende poner en contacto un material que comprende β-D-glucano con un polipéptido de la invención;
- un método para la identificación de un compuesto que modula la actividad de β-glucanasa, cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba en la presencia de β-D-glucano y monitorear o detectar cualquier modulación de la actividad;
- un método para tratar un sujeto que tiene hiperlipidemia cuyo método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido de la invención; y
- el uso de un polipéptido en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de hiperlipidemia.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID No. 1 es una secuencia de ADN de una primera β-glucanasa (CEA) de la invención de Talaromices emersonii,

SEQ ID No. 2 es la secuencia de aminoácido de la primera β-glucanasa, CEA;

SEQ ID Nos. 7 y 8 son cebadores de PCR que hibridizan a la SEQ ID No. 1 (y se utilizaron para reclinar los insertos de cADN durante el análisis genético de los transformantes positivos).

Descripción detallada de la invención

A. Polinucleótidos

La presente invención suministra un polinucleótido (por ejemplo, aislado y/o purificado) que codifica polipéptidos de la invención. La presente invención suministra así un polinucleótido que codifica una β-glucanasa cuya secuencia de aminoácido se establece en la SEQ ID No. 2. La presente invención suministra además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una homología de secuencia de aminoácido sustancial con la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 2. También se incluye un polinucleótido seleccionado de:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 1, o el complemento... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un polipéptido, que es una β-glucanasa obtenible de un hongo del género Talaromices, tal como el hongo Talaromices emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende:

(i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2; o
(ii) una variante de (i) que es capaz de dividir el β-D-glucano que tiene por lo menos 70% de identidad sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 2 o por lo menos 80% sobre una región de por lo menos 150 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2; o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir el β-D-glucano.

2. El polipéptido de acuerdo a la Reivindicación 1 en donde la variante (ii) tiene por lo menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2 y/o el fragmento de (iii) es de por lo menos 150 aminoácidos de longitud.

3. El polipéptido de acuerdo a la Reivindicación 1 que divide los enlaces (1\rightarrow3), (1\rightarrow4) y/o (1\rightarrow6) en β-D-glucano.

4. Un polinucleótido que comprende:

(a) la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo a cualquier reivindicación precedente;
(b) una secuencia que es complementaria a, o que se hibrida bajo condiciones de alta exigencia, una secuencia como se definió en (a) sobre la longitud completa;
(c) una secuencia modificada de la SEQ ID No. 1 con hasta 100 sustituciones de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene una actividad β-Glucanasa.
(d) una secuencia que tiene por lo menos 75%, preferiblemente 80%, de identidad con una secuencia como se definió en (a); o
(e) una secuencia que se degenera como resultado del código genético a una cualquiera de las secuencias como se definió en (a).

5. El polinucleótido de acuerdo a la Reivindicación 4 en donde la secuencia codifica un polipéptido que tiene actividad β-glucanasa.

6. El polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 5, que es una secuencia de ADN.

7. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 6.

8. El vector de acuerdo a la Reivindicación 7, que es un vector de expresión, tal como donde una secuencia de ADN de acuerdo con la Reivindicación 7 está operablemente ligada a la secuencia regulatoria.

9. Una célula huésped, que comprende, como una secuencia heteróloga, un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 6.

10. Una célula huésped, que expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

11. Una célula huésped transformada con la secuencia de ADN de la Reivindicación 5 o un vector de la Reivindicación 7.

12. un proceso para producir un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, el proceso comprende cultivar una célula huésped como se definió en cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11 bajo condiciones que suministran para la expresión del polipéptido.

13. El uso de un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de un medicamento para tratar hiperlipidemia y/o niveles altos de colesterol y triglicéridos en el suero en un individuo.

14. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad de β-glucanasa, el método comprende poner en contacto un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 con un compuesto de prueba y monitorear la actividad de β-glucanasa.

15. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

16. La composición de acuerdo a la Reivindicación 15, que comprende además un polipéptido que tiene actividad de celulasa, endo-arabinanasa, ramnogalacturonasa o poligalacturonasa.

17. Un método para tratar material vegetal, el método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 o una composición de acuerdo a la Reivindicación 15 o Reivindicación 16.

18. Un método de acuerdo a la Reivindicación 17 en donde el tratamiento comprende degradar o modificar la celulosa, tal como β-glucan, en el material vegetal.

19. Un método de acuerdo a la Reivindicación 18 para degradar o modificar las paredes de la célula vegetal.

20. Un método de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 19 en donde el tratamiento comprende dividir unas subunidades de glucosa de un componente de β-D-glucan del material.

21. Un método de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 19 en donde el material comprende una planta, una pulpa de planta, extracto de planta o un alimento comestible o ingrediente de éste, o una tela, textil o prendas que contienen material vegetal.

22. Un método para reducir la viscosidad del material vegetal, el método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 o una composición de acuerdo a la Reivindicación 15 o Reivindicación 16 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para degradar la celulosa contenida en el material.

23. Uso de un polipéptido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 o una composición de acuerdo a la Reivindicación 15 o Reivindicación 16 en un método para tratar el material vegetal.

24. Uso de acuerdo a la Reivindicación 23 en donde el tratamiento comprende dividir los polímeros de β-D-glucano en el material vegetal.

25. Uso de un polipéptido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 o una composición de acuerdo a la Reivindicación 15 o Reivindicación 16 en un método para procesar pulpa, jugo o extracto de planta cuyo método comprende incubar la pulpa, jugo o extracto con el polipéptido o composición a por lo menos celulosa parcialmente degradada.

26. Un alimento (animal) que comprende un polipéptido de acuerdo a una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

27. Uso de un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en preparación de cerveza, destilado, biometanación, higiene dental, tratamiento de cuero, manufactura de papel, tratamiento o manufactura textil, horneado y elaboración de pan, lavado o tratamiento con detergente, tratar bulbos de flores o en alimento animal.

28. Un alimento o material que comprende un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

29. Un alimento o un material de acuerdo a la Reivindicación 28, que es una bebida alcohólica, pan, masa o té.

30. Un organismo de planta transgénica que comprende una célula de acuerdo a la Reivindicación 10 u 11.

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