Arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con PEG.

Un conjugado que comprende una L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa recombinante y al menos un resto de polietilenglicol,

en donde la secuencia de aminoácidos de la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa es la SEQ ID NO: 8, y en donde el al menos un resto de polietilenglicol tiene un peso molecular medio ponderal de 1.000 Dalton a 10.000 Dalton.

Arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con PEG

Campo de la invención La presente invención se refiere a una arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con polietilenglicol.

Fundamento de la invención 5

Desde hace décadas se vienen realizando tremendos esfuerzos para recoger sustancias farmacológicamente activas de organismos naturales y analizar sus efectos en diversos campos de enfermedades.

La liebre de mar, Aplysia punctata, produce una tinta de color púrpura que la protege de sus predadores. Se había demostrado que esta tinta contenía una actividad antitumoral (Butzke et al., ) . Posteriormente, se realizaron estudios para aislar el factor de la tinta en bruto, dando como resultado el descubrimiento de la toxina de Aplysia Punctata, 10 abreviadamente en lo sucesivo APIT (por la expresión inglesa Aplysia Punctata Ink Toxin) . Recientemente, el factor fue clonado y caracterizado siendo una L-aminoácido-oxidasa de unión a dinucleótido de flavina-adenina (FAD) débilmente glicosilada que cataliza la desaminación oxidante de L-lisina y L-arginina y produce por tanto peróxido de hidrógeno (H2O2) , amonio (NH4+) y los correspondientes alfa-cetoácidos (Butzke et al., 2005) .

Las enzimas L-aminoácido-oxidasas (abreviadamente LAAO, EC 1.4.3.2) se pueden encontrar en secreciones y 15 venenos. Los miembros de esta familia de flavoenzimas catalizan la desaminación oxidante estereoespecífica de L-aminoácidos y por tanto producen H2O2, amonio y los alfa-cetoácidos correspondientes (Du et al., 2002) . Las enzimas LAAO individuales difieren en su especificidad de sustrato: las L-aminoácido-oxidasas de veneno de serpiente (abreviadamente sv-LAAO) que constituyen hasta el 30% (en peso) del veneno en bruto (Ponndurai et al., 1994) poseen una clara preferencia por los aminoácidos hidrófobos. Una LAOO en cápsulas de aceite de pescado 20 denominada proteína inductora de la apoptosis (abreviadamente AIP por la expresión inglesa Apoptosis Inducing Protein) que es inducida por infección por larvas de nemátodos de Scomber japonicus es altamente específica para la L-lisina (Jung et al., 2000) . La achacina una LAAO del moco del caracol africano Achatina fulica, metaboliza una gama muy amplia de sustratos, que incluyen aminoácidos hidrófobos junto con L-lisina, L-arginina, L-cisteína, L-asparagina y L-tirosina (Ehara et al., 2002) . 25

En las L-aminoácido-oxidasas no se ha investigado su semivida después de la administración a mamíferos por ninguna vía. Sin embargo, en lo que respecta al desarrollo de fármacos éste es un aspecto importante y un requisito previo para ejercer eficazmente un efecto terapéutico. Los datos a este respecto, sólo están disponibles para un D-aminoácido-oxidasa que emplea D-prolina como sustrato (Fang et al., 2002) . Después de la inyección intravenosa, la D-aminoácido-oxidasa natural fue, sin embargo, eliminada rápidamente de la circulación. Un derivado pegilado no 30 produjo un aumento significativo del tiempo de semivida en circulación que estaba muy por debajo de 1 hora. Un producto con un corto tiempo de semivida en circulación no se puede esperar que tenga un beneficio terapéutico importante para terapia, por ejemplo, para la terapia del cáncer. Por lo tanto, de acuerdo con la enseñanza de la técnica anterior cabía esperar que las aminoácido-oxidasas pegiladas carecerían de eficacia terapéutica.

El documento de patente JP 2003 292457 A describe un agente antitumoral que contiene una D-aminoácido-35 oxidasa, tal como xantinoxidasa, con un polímero, tal como PEG, que se acumula en un tumor.

Sawa et al., (Cancer Research 2000; 60 (3) : 666-671) describen un conjugado de xantinoxidasa-polímero que genera radicales libres de oxígeno en un tejido tumoral.

La solicitud de patente EP0898968A1 describe un agente antitumoral que comprende un complejo de una óxidorreductasa y un polímero y un sustrato de la enzima, que tiene actividad citotóxica selectiva para tumores. 40

Lukasheva et al., (Biochemistr y 2002; 67 (10) : 1394-1402) describe las propiedades físico-químicas y biológicas de L-lisina-alfa-oxidasa, que es una enzima obtenida del extracto del cultivo fúngico en salvado de trigo de Trichoderma viride.

Un objeto de la presente invención era aumentar la eficacia terapéutica de las L-aminoácidos-óxidorreductasas con el fin de proporcionar un producto terapéutico con características mejoradas. 45

Sumario de la invención La presente invención aborda por primera vez una arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con al menos un resto de polietilenglicol y composiciones farmacéuticas que comprenden dicha arginina/lisina-óxidorreductasa modificada, un método de producción de las mismas y métodos para el tratamiento de enfermedades sensibles a la modulación de los niveles de aminoácidos en plasma o/y sensibles a las especies con oxígeno reactivo o/y al amonio, por 50 ejemplo enfermedades proliferantes.

En una realización preferida, una arginina/lisina-óxidorreductasa denominada toxina de la tinta de Aplysia punctata (APIT) está modificada con al menos un resto de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio ponderal de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000. Una realización adicional de la invención describe métodos de producción de una arginina/lisina-óxidorreductasa pegilada. 5 Una realización adicional describe un método para mejorar la actividad enzimática y el tiempo en circulación de una arginina/lisina-óxidorreductasa que comprende la pegilación de una arginina/lisina-óxidorreductasa. Otra realización se refiere a un método para proteger una arginina/lisina-óxidorreductasa contra la inactivación por 10 los fluidos corporales, que comprende la pegilación de una arginina/lisina-óxidorreductasa. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para agotar en un líquido los aminoácidos lisina o/y arginina, que comprende añadir al líquido una arginina/lisina-óxidorreductasa. 15 Incluso otra realización se refiere a un kit que comprende una arginina/lisina-óxidorreductasa de la presente invención.

Descripción detallada de la invención El objeto de la presente invención se logra modificando covalentemente las arginina/lisina-óxidorreductasas, en particular un conjugado que comprende una arginina/lisina-óxidorreductasa recombinante y al menos un resto de 20 polietilenglicol, en donde la secuencia de aminoácidos de la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa es la SEQ ID NO:8 y en donde al menos un resto de polietilenglicol tiene un peso molecular medio ponderal de 1.000 Dalton a 10.000 Dalton. La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las arginina/lisina-óxidorreductasas modificadas con polietilenglicol circulan en el plasma de ratones durante más de 48 horas y retienen su actividad enzimática. En contraste, las arginina/lisina-óxidorreductasas sin modificar son activas en la circulación solamente 25 durante aproximadamente 3 horas a la dosis basadas en actividades equivalentes.

Además, se encontró sorprendentemente que la dosificación de una arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con PEG puede ser significativamente reducida en comparación con la arginina/lisina-óxidorreductasa no modificada.

Por otra parte, se encontró sorprendentemente que la arginina/lisina-óxidorreductasa modificada con PEG tiene un menor valor de la CI50 para la inhibición de células tumorales de pulmón que la arginina/lisina-óxidorreductasa no 30 modificada.

Además, las arginina/lisina-óxidorreductasas modificadas con polietilenglicol proporcionan un medio único de disminuir los niveles de los aminoácidos lisina y arginina, produciendo con ello especies con oxígeno reactivo y amonio. Todos estos efectos o partes de ellos son suficientes para tratar ciertos tipos de trastornos. Cuando se compara con una arginina/lisina-óxidorreductasa natural, una arginina/lisina-óxidorreductasa pegilada retiene la 35 mayoría de su actividad enzimática, es capaz de agotar la lisina y arginina en mamíferos durante 48 horas y más, y es mucho más eficaz en el tratamiento de enfermedades sensibles a una modificación de los niveles de aminoácidos y/o especies con oxígeno reactivo o amonio. Por otra parte, la arginina/lisina-óxidorreductasa pegilada es activa incluso en presencia de anticuerpos específicos dirigidos a la arginina/lisina-óxidorreductasa no modificada.

"Conjugado" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un compuesto que comprende una porción de 40 polipéptido que incluye preferiblemente una coenzima, tal como FAD a la que se ha acoplado, por un enlace covalente, al menos un resto de polietilenglicol.

El conjugado de la presente invención puede comprender... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado que comprende una L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa recombinante y al menos un resto de polietilenglicol, en donde la secuencia de aminoácidos de la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa es la SEQ ID NO: 8, y en donde el al menos un resto de polietilenglicol tiene un peso molecular medio ponderal de 1.000 Dalton a 10.000 Dalton. 5

2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el al menos un resto de polietilenglicol está acoplado covalentemente a la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa por medio de un grupo de unión, preferiblemente un grupo succinimida.

3. El conjugado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 10, restos de polietilenglicol. 10

4. Composición farmacéutica que comprende un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente junto con vehículos, adyuvantes, diluyentes o/y aditivos farmacéuticamente aceptables.

5. Un método para producir el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas de:

(a) expresar recombinantemente la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa, y 15

(b) acoplar c al menos un resto de polietilenglicol a la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa de (a) , en donde al menos un resto de polietilenglicol tiene un peso molecular medio ponderal de 1.000 Dalton a 10.000 Dalton.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la etapa (a) comprende una expresión recombinante de un ácido nucleico, en donde la secuencia del ácido nucleico es SEQ ID NO: 7.

7. Un kit que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o/y la composición 20 farmacéutica de la reivindicación 4.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde el conjugado se caracteriza por una actividad enzimática o/y un tiempo en circulación mejorados de la L-arginina/L-lisina-óxidorreductasa.

9. Composición farmacéutica de la reivindicación 4, para uso en la prevención, alivio, o/y tratamiento de una enfermedad proliferante, tal como cáncer. 25